aFGF誘導(dǎo)大鼠BMSCs分化為NSCs的實驗研究.pdf

1、第一部分大鼠BMSCs的體外培養(yǎng)、純化和鑒定
　　 目的:體外培養(yǎng)并純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs);研究其生物學(xué)特性;檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物以鑒定細(xì)胞。
　　 方法:采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法對大鼠BMSCs進(jìn)行培養(yǎng)，并通過傳代培養(yǎng)進(jìn)行純化細(xì)胞。在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)特征;通過四甲基偶氮唑鹽(MTT)法以繪制細(xì)胞的生長曲線;用流式細(xì)胞儀(FCM)測定第3代BMSCs的細(xì)胞周期，并鑒定細(xì)胞表面標(biāo)志物。
　　

2、 結(jié)果:培養(yǎng)的細(xì)胞呈貼壁生長，表現(xiàn)為長梭形、多角形。第1、3、5代細(xì)胞的生長曲線均呈S形，活性無明顯差異。細(xì)胞周期顯示94.34％細(xì)胞處于G0/G1期，有較強的分裂增殖能力。FCM檢測CD29、CD54、CD90表達(dá)陽性，CD45表達(dá)陰性。
　　 結(jié)論:全骨髓貼壁培養(yǎng)法能培養(yǎng)出高純度的大鼠BMSCs。細(xì)胞生長穩(wěn)定、增殖快、可多次傳代，具有干細(xì)胞特性。
　　 第二部分 aFGF誘導(dǎo)大鼠BMSCs分化為NSCs并鑒定NSCs

3、
　　 目的:研究酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)分化為神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的可行性，最佳作用劑量和最佳誘導(dǎo)時間，并鑒定分化前后的細(xì)胞。
　　 方法:全骨髓貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠BMSCs。實驗組（aFGF誘導(dǎo)組-A組）分別用10、20、40、60、80、100、120ng/ml aFGF進(jìn)行誘導(dǎo)分化，陽性對照組（bFGF誘導(dǎo)組-B組）用20ng/ml bFGF誘導(dǎo)分化，陰性對照組（

4、N組）不加任何誘導(dǎo)劑。在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞誘導(dǎo)前后的形態(tài)特征變化。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測各組細(xì)胞神經(jīng)巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)的基因表達(dá)。免疫熒光染色法檢測Nestin、NSE的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:RT-PCR結(jié)果顯示Nestin、NSE mRNA在不同組均有表達(dá)，aFGF的最佳作用劑量為80ng/ml。以80ng/ml的aFGF進(jìn)行后續(xù)誘導(dǎo)分化實驗，RT-PCR結(jié)果顯示以誘

5、導(dǎo)6h后A組中Nestin mRNA表達(dá)最強，與其余各組比較（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義;隨著誘導(dǎo)時間的延長，Nestin mRNA表達(dá)呈逐漸減弱趨勢。在誘導(dǎo)6d后各組比較，A組中NSE mRNA表達(dá)最強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。誘導(dǎo)6h后可見少數(shù)細(xì)胞的胞體收縮成橢圓形并伸出細(xì)長突起，免疫熒光染色顯示Nestin蛋白表達(dá)陽性;誘導(dǎo)6d后絕大部分細(xì)胞突起呈兩極或多極形狀，并交織成網(wǎng)狀，免疫熒光染色顯示NSE蛋白表達(dá)陽性。<