Disulfiram-Cu復(fù)合物聯(lián)合阿霉素對HL60-Dox細(xì)胞的作用及其與JNK-c-Jun通路關(guān)系的研究.pdf

1、背景
　　 急性白血病(AL)是我國十大惡性腫瘤之一,是青少年和35歲以下成年人發(fā)病率最高的惡性腫瘤；近年來隨著室內(nèi)外環(huán)境污染等因素的影響,其發(fā)病率逐年上升,嚴(yán)重影響人民健康,其中急性髓系白血病(AML)是成人AL最常見的類型。盡管隨著化療方案的不斷改善,AML完全緩解(CR)率可達(dá)70％左右,但大部分患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā),一旦復(fù)發(fā),再次緩解率低,預(yù)后差,難治復(fù)發(fā)是目前導(dǎo)致AML治療失敗的最根本因?yàn)?。化療是治療AML的首選方法,目前臨

2、床上影響AML化療效果進(jìn)一步提高主要存在兩個(gè)障礙:一是白血病細(xì)胞對化療藥物的不敏感或獲得性的耐藥；二是化療藥物對一些重要的組織和器官存在的非特異性的毒性,限制化療藥物有效劑量的提高。
　　 由于化療導(dǎo)致的系統(tǒng)性毒性和藥物耐藥是白血病化療成功的主要障礙,而新的分子靶向藥物也存在價(jià)格昂貴和耐藥問題,從傳統(tǒng)價(jià)廉藥物中開發(fā)具有抗白血病活性并有可能增強(qiáng)傳統(tǒng)化療藥物效果的“老藥新用”途徑越來越引起重視。Disulfiram(DS)是臨床應(yīng)用

3、超過60年的抗酗酒藥物,安全性好,價(jià)格低廉。研究發(fā)現(xiàn)DS單藥可以誘導(dǎo)一系列實(shí)體瘤細(xì)胞的凋亡及抑制其增殖,但是關(guān)于其對白血病細(xì)胞的作用尚存爭議。作為二價(jià)金屬離子螯合劑,DS能夠夠強(qiáng)烈螯合Cu離子形成DS/Cu復(fù)合物,且DS/Cu復(fù)合物可顯著提高DS誘導(dǎo)實(shí)體瘤和白血病細(xì)胞凋亡的作用,在殺傷腫瘤細(xì)胞的作用中DS和Cu是相輔相成的。
　　 c-jun N端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)家族是MAPK(絲裂

4、原激活的蛋白激酶)家族中重要的一員,JNK是一種特異性磷酸化核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子c-jun的激酶,通過使c-jun第63、73位絲氨酸雙磷酸化,提高其轉(zhuǎn)錄活性,從而提高激活蛋白(AP-1)的轉(zhuǎn)錄活性并抑制泛素介導(dǎo)的c-jun降解,在細(xì)胞生長、癌基因轉(zhuǎn)化、細(xì)胞分化和凋亡等發(fā)揮重要作用。近來研究發(fā)現(xiàn)JNK/c-Jun通路在AL的發(fā)病機(jī)制中也占有重要地位,與AL的發(fā)生、發(fā)展及耐藥機(jī)制密切相關(guān)。研究表明JNK/c-Jun通路活化失敗是AML治療中蒽環(huán)類

5、藥物耐藥的可能機(jī)制之一,而JNK/c-Jun通路活化可以通過誘導(dǎo)凋亡逆轉(zhuǎn)白血病和實(shí)體瘤細(xì)胞耐藥。因此JNK/c-Jun通路失活可能是同多藥耐藥(MDR)相關(guān)的另外一個(gè)重要機(jī)制并且可能是逆轉(zhuǎn)耐藥的一個(gè)作用靶點(diǎn)。
　　 國外研究報(bào)道顯示DS/Cu復(fù)合物可以增強(qiáng)實(shí)體瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性,但是它的作用靶點(diǎn)和分子機(jī)理尚存爭議。DS/Cu復(fù)合物聯(lián)合其他傳統(tǒng)化療藥物有望一方面提高化療藥物對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用,減少耐藥發(fā)生；另一方面降低化療

6、藥物的使用劑量,從而減少化療藥物對人體的毒性。目前關(guān)于DS/Cu復(fù)合物對耐藥白血病細(xì)胞的作用研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道,本課題旨在探討DS/Cu復(fù)合物能否增強(qiáng)阿霉素(Dox)對人急性髓系白血病多藥耐藥細(xì)胞株HL,60/Dox的敏感性及其與JNK/c-Jun通路的關(guān)系。
　　 研究目的：
　　 白血病細(xì)胞對化療耐藥是導(dǎo)致白血病治療失敗的根本因?yàn)?逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞耐藥是提高白血病療效的重要手段。本課題以耐阿霉素(Dox)的人急性髓系白

7、血病多藥耐藥細(xì)胞株HL60/Dox為研究對象,探討DS/Cu能否在體外增強(qiáng)耐藥HL60/Dox細(xì)胞對阿霉素的敏感性,并進(jìn)一步從JNK/c-Jun通路深入探討其潛在的分子機(jī)制。
　　 方法
　　 1、細(xì)胞株:耐阿霉素的人急性髓系白血病細(xì)胞株HL60/Dox及其野生型HL60細(xì)胞株。
　　 2、MTT法檢測阿霉素對耐藥HL60/Dox和野生型HL60細(xì)胞的體外增殖抑制作用,評價(jià)HL60/Dox細(xì)胞的耐藥性。
　

8、　 3、MTT法檢測不同濃度DS聯(lián)合Cu離子(1μM)作用24和48小時(shí)后對HL60/Dox細(xì)胞的體外增殖抑制作用。
　　 4、MTT法評價(jià)無明顯增殖抑制作用的IC20濃度的DS/Cu復(fù)合物處理HL60/Dox細(xì)胞24小時(shí)后能否增強(qiáng)HL60/Dox細(xì)胞對阿霉素的敏感性。
　　 5、Annexin V-FITC/PI雙染檢測阿霉素、DS/Cu單藥組、DS/Cu聯(lián)合阿霉素組及空白對照組作用HL60/Dox 24小時(shí)后凋亡細(xì)

9、胞比例；為明確DS/Cu增強(qiáng)HL60/Dox細(xì)胞對阿霉素的敏感性是否同JNK/c-Jun通路相關(guān),應(yīng)用JNK/c-Jun通路抑制劑Sp600125(20uM)對HL60/Dox細(xì)胞預(yù)處理2小時(shí),然后給予上述各組相同的處理,并進(jìn)行凋亡細(xì)胞比例檢測。
　　 6、倒置顯微鏡下觀察上述各個(gè)處理組作用24小時(shí)后HL60/Dox細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　 7、Western Bloting檢測上述各個(gè)處理組作用24小時(shí)后HL60/Dox

10、細(xì)胞內(nèi)JNK,磷酸化JNK(p-JNK及其下游分子c-Jun、磷酸化c-Jun(p-c-Jun)和Bcl-2蛋白表達(dá)變化。
　　 8、采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組間均數(shù)的比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法:配對計(jì)量資料的比較采用配對樣本t檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì),在方差分析顯著的情況下使用Bonferroni(方差齊性)進(jìn)行多重比較；若方差不齊則采用近似F檢驗(yàn)(如Welch方法)代替方差分析后

11、采用Dunnett T3方法進(jìn)行多重比較；計(jì)量資料用x±s表示,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05,雙側(cè)檢驗(yàn)。
　　 結(jié)論
　　 1、DS/Cu復(fù)合物本身對HL60/Dox細(xì)胞具有一定的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用,無明顯抑制增殖作用IC20濃度的DS/Cu可以通過抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡提高阿霉素對HL60/Dox細(xì)胞的毒性作用。
　　 2、DS/Cu復(fù)合物聯(lián)合阿霉素能夠增JJIHL60/Dox細(xì)胞內(nèi)磷酸化JNK(p-JNK)、磷酸化