超聲輻照聯(lián)合酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物抗腫瘤研究.pdf

1、目的:本實驗通過生物素-親和素橋?qū)F(tuán)聚的酸敏雙配體阿霉素前藥與微泡結(jié)合，形成酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物，并探討微泡介導(dǎo)的超聲輻照作用是否能將團(tuán)聚的大粒徑載藥顆粒分散破碎成小粒徑顆粒，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對藥物的攝取。本實驗對超聲作用前后酸敏雙配體阿霉素前藥及其復(fù)合物的形態(tài)及粒徑變化進(jìn)行考察，并通過系列體內(nèi)外實驗探究該策略的腫瘤靶向性、抗腫瘤能力及相關(guān)機(jī)制。
　　方法:1.合成酸敏雙配體阿霉素前藥
　　按摩爾比稱取一定量的羧

2、基化肝素、氨基化葉酸、氨基化生物素、PEG-cRGD以及催化劑量的1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)、羥基琥珀酰亞胺(NHS)下溶于二甲基亞砜(DMSO)中，室溫反應(yīng)24 h后置于透析膜中透析48 h。通過腙鍵將阿霉素連接于載體肝素上，得酸敏雙配體阿霉素前藥。
　　2.酸敏雙配體阿霉素前藥的表征
　　動態(tài)光散射儀測量酸敏雙配體阿霉素前藥的粒徑大小;透射電鏡觀察酸敏雙配體阿霉素前藥的形態(tài)及粒徑;紫

3、外分光光度法測定載藥量。
　　3.酸敏雙配體載阿霉素前藥-微泡復(fù)合物的制備
　　3.1 生物素化脂質(zhì)微泡的制備
　　3.2 酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物的制備
　　4.超聲輻照裝置
　　本實驗超聲輻照由CZ906A超聲空化治療儀（四川綿陽索尼克電子有限責(zé)任公司）產(chǎn)生，根據(jù)前期實驗體外細(xì)胞實驗設(shè)定參數(shù)為:頻率1 MHz，占空比50％，作用時間1 min，功率1 W/cm2;體內(nèi)動物實驗設(shè)定參數(shù)為:頻率1

4、MHz，占空比50％，作用時間1 min，功率2 W/cm2。
　　5.酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物的表征
　　透射電鏡分別觀察超聲作用前酸敏雙配體阿霉素前藥的形態(tài)及超聲作用于復(fù)合物后該前藥的形態(tài);動態(tài)光散射儀分別測量超聲作用前酸敏雙配體阿霉素前藥的粒徑大小及電位，及超聲作用于復(fù)合物后該前藥的粒徑大小及電位;激光共聚焦顯微鏡觀察脂質(zhì)微泡與帶紅色熒光的酸敏雙配體阿霉素前藥的連接情況及超聲作用后復(fù)合物的形態(tài);庫爾特計數(shù)儀對復(fù)

5、合物進(jìn)行粒徑分析;計算酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物的載藥量。
　　6.超聲輻照聯(lián)合酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物體內(nèi)外抗腫瘤特性研究
　　6.1 體外實驗
　　6.1.1 體外藥物釋放實驗
　　6.1.2 流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞攝取情況
　　6.1.3 MTT細(xì)胞毒性實驗比較游離阿霉素、酸敏雙配體阿霉素前藥及超聲輻照聯(lián)合酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物對MCF-7乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用。
　　6.

6、2 體內(nèi)實驗
　　6.2.1 超聲分子靶向成像
　　6.2.2 活體熒光成像實驗
　　6.2.3 體內(nèi)抑瘤實驗
　　6.2.4 組織學(xué)實驗
　　7.統(tǒng)計學(xué)分析:
　　采用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以(x)±s表示。采用兩獨立樣本t檢驗、單因素方差分析及重復(fù)測量方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。設(shè)P＜0.05為差異性檢驗水準(zhǔn)，定義*為p＜0.05，**為p＜0.01，***為p＜0.0

7、01。
　　結(jié)果:1.酸敏雙配體載阿霉素前藥的表征
　　DLS檢測發(fā)現(xiàn)酸敏雙配體載阿霉素前藥呈不均一的粒徑分布，大部分粒徑較?。?49.6±29.8 nm），小部分粒徑較大(1036.2±38.8 nm)。透射電子顯微鏡檢測其形態(tài)及粒徑發(fā)現(xiàn)，酸敏雙配體阿霉素前藥顆粒呈現(xiàn)略不規(guī)則的球形，部分聚集成團(tuán)。紫外分光光度法測定酸敏雙配體阿霉素前藥載藥量約18.9％。
　　2.酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物的表征
　　2.

8、1 透射電鏡觀察可見超聲作用后團(tuán)聚的酸敏雙配體阿霉素前藥被破碎成均勻的小顆粒，呈類圓形的球體，DLS檢測可見該前藥粒徑分布（平均直徑:128.6±42.3 nm，PDI:0.21），電位為-20.6±3.4 mV，結(jié)果與透射電鏡觀察所得一致。
　　2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察見超聲作用前酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物分布均勻，無聚集現(xiàn)象，外殼發(fā)出紅色熒光，表明帶紅色熒光的酸敏雙配體阿霉素前藥成功連接于微泡上。超聲作用后，復(fù)合物被

9、破碎成帶紅色熒光的均勻分布的碎片，提示超聲外力作用于復(fù)合物有助于團(tuán)聚顆粒分散均勻。
　　2.3 紫外分光光度計檢測可得酸敏雙配體阿霉素前藥的載藥量約18.9％，計算可得復(fù)合物的載藥量約70.9μg DOX/108 MBs。庫爾特計數(shù)儀測得該復(fù)合物粒徑為5.87±0.08μm，PDI為0.09。
　　3.超聲輻照聯(lián)合酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物體內(nèi)外抗腫瘤特性研究
　　3.1體外實驗
　　3.1.1 體外藥物釋

10、放實驗
　　在pH7.4的PBS緩沖液中，酸敏雙配體阿霉素前藥組及其復(fù)合物聯(lián)合超聲作用組的阿霉素釋放率均約30％，而在pH5.0緩沖液中，兩者的阿霉素釋放率分別提高至84％和90％，表明兩者均具有較好的酸敏特性，提示微泡與該前藥結(jié)合并未影響其酸敏特性，且超聲的物理力學(xué)作用使超聲聯(lián)合復(fù)合物組的阿霉素釋放率稍高于單獨酸敏雙配體阿霉素前藥組。
　　3.1.2 細(xì)胞攝取實驗
　　流式細(xì)胞攝取實驗可見，酸敏雙配體阿霉素前藥組及超

11、聲輻照聯(lián)合酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物組的細(xì)胞攝取率明顯高于對照組及游離阿霉素組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)，提示腙鍵的酸敏特性及雙配體的雙重靶向性均可促進(jìn)阿霉素的細(xì)胞攝取，且超聲輻照聯(lián)合復(fù)合物的細(xì)胞攝取率較單獨的酸敏雙配體阿霉素前藥有所提高，可能原因為超聲輻照通過使團(tuán)聚藥物破碎、粒徑減小，使細(xì)胞膜通透性增加等機(jī)制進(jìn)一步促進(jìn)藥物進(jìn)入細(xì)胞。
　　3.1.3 MTT細(xì)胞毒性實驗
　　游離阿霉素、酸敏雙配體阿霉素前藥

12、及超聲輻照聯(lián)合酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物的細(xì)胞殺傷能力呈逐步上升趨勢(IC50值分別為310.35 ng/mL，217.43 ng/mL，120.23 ng/mL)。綜合上述藥物釋放實驗及細(xì)胞攝取實驗結(jié)果，考慮酸敏雙配體阿霉素前藥在腙鍵的酸敏特性、雙配體的雙重靶向性及超聲的物理力學(xué)及生物學(xué)作用下，通過促進(jìn)阿霉素的釋放及增加細(xì)胞攝取，抑制腫瘤細(xì)胞生長。
　　3.2 體內(nèi)實驗
　　3.2.1 超聲分子靶向成像
　　超

13、聲分子靶向成像數(shù)據(jù)采集后用彩色編碼分析軟件MCE進(jìn)行圖像分析，圖像聲強(qiáng)度以彩色編碼顯示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物組腫瘤區(qū)域的聲強(qiáng)度(52.785±4.341 a.u.)顯著高于空白微泡組(15.021±2.340 a.u.)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.001），提示酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物靶向結(jié)合于腫瘤組織的微泡量多于空白微泡，具有更強(qiáng)的腫瘤靶向顯像特性。
　　3.2.2 動物活體熒光成像
　　相

14、對于Cy5.5標(biāo)記的酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物無超聲輻照組及游離Cy5.5組，超聲輻照聯(lián)合Cy5.5標(biāo)記的酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物組在腫瘤區(qū)域的熒光信號顯著增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)，其中以超聲輻照聯(lián)合復(fù)合物注射后0.5 h最強(qiáng)，定量數(shù)據(jù)顯示差異可達(dá)3.5倍(p＜0.001），表明超聲輻照聯(lián)合復(fù)合物可使載藥體系更早地在腫瘤區(qū)域達(dá)到更高的蓄積水平。
　　3.2.3 體內(nèi)抑瘤實驗
　　體內(nèi)抑瘤實驗分為

15、對照組、游離阿霉素組、復(fù)合物無超聲作用組及復(fù)合物聯(lián)合超聲作用組。結(jié)果顯示，相對于對照組，其余各組均顯示出一定程度的腫瘤生長抑制。其中，阿霉素組的腫瘤抑制能力比復(fù)合物無超聲作用組強(qiáng)，而復(fù)合物聯(lián)合超聲作用組顯示出最強(qiáng)的腫瘤抑制能力（與對照組相比p＜0.001，與復(fù)合物無超聲作用組相比p＜0.01，與游離阿霉素組相比p＜0.05）。
　　各組裸鼠體重統(tǒng)計圖顯示，相對于對照組，游離阿霉素組裸鼠體重明顯降低(p＜0.05)，提示其具有一定程

16、度的系統(tǒng)毒性，復(fù)合物無超聲作用組裸鼠體重?zé)o明顯降低，而復(fù)合物聯(lián)合超聲作用組與對照組相比體重差異最小，顯示出最低的系統(tǒng)毒性。
　　3.2.4 組織學(xué)實驗
　　3.2.4.1 HE染色檢測藥物毒性
　　3.2.4.2 免疫組化檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖及血管生成指標(biāo)。結(jié)果表明超聲輻照聯(lián)合酸敏雙配體阿霉素前藥-微泡復(fù)合物可能通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖及抗血管生成等多種機(jī)制發(fā)揮其抗腫瘤作用。
　　結(jié)論:1.成功制備攜帶雙