Bit1在食管鱗癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用及機(jī)制初探.pdf

1、背景與目的：
　　食管鱗癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）是具有中國特色的高發(fā)惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展涉及到多個(gè)信號(hào)途徑的改變，包括一些抗凋亡因子功能的激活或者凋亡因子功能的抑制。Bit1(Bcl-2 inhibitor of transcription1)于2004年發(fā)現(xiàn)，有研究認(rèn)為 Bit1定位在線粒體發(fā)揮促凋亡作用，細(xì)胞在受到失黏附刺激時(shí)， Bit1蛋白會(huì)轉(zhuǎn)移釋放到胞漿內(nèi)并與其

2、中的AES(amino-terminalenhancer of split)蛋白作用形成復(fù)合物，抑制Bcl-2的轉(zhuǎn)錄從而參與細(xì)胞的失巢凋亡。也有報(bào)道認(rèn)為Bit1蛋白富集在高爾基體，活化MAPK信號(hào)途徑發(fā)揮抗凋亡作用。Bit1和腫瘤關(guān)系的相關(guān)研究甚少，并且觀點(diǎn)也不一致，而其在ESCC中的作用，除了本課題組的研究外鮮有報(bào)道。
　　研究表明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有著密切的聯(lián)系。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchym

3、al Transition，EMT）即上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有活性的間充質(zhì)細(xì)胞，該過程主要特征是上皮標(biāo)志蛋白表達(dá)降低而間質(zhì)標(biāo)志蛋白表達(dá)升高、上皮細(xì)胞極性缺失、細(xì)胞與基底膜間的連接溶解及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)等，從而使得細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移、抗凋亡能力增強(qiáng)。因此，EMT是惡性腫瘤細(xì)胞增強(qiáng)侵襲與遷移能力從而發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵生物學(xué)過程。
　　本課題組前期研究表明，Bit1在ESCC中表達(dá)升高且和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，下調(diào)ESCC細(xì)胞中Bit1表達(dá)后可抑制ESCC

4、細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，但具體機(jī)制不清，為了進(jìn)一步探討B(tài)it1和ESCC侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系及其分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)通過（1）ESCC細(xì)胞中Bit1表達(dá)水平的變化與EMT相關(guān)蛋白水平表達(dá)的關(guān)系研究；（2）具有高侵襲能力ESCC細(xì)胞亞系的篩選及其形態(tài)、生物學(xué)行為變化的檢測(cè)；（3）Bit1在轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞發(fā)生 EMT中的作用研究；（4）初步驗(yàn)證前期基因

5、芯片所篩選的Bit1下游效應(yīng)分子等四個(gè)部分來研究Bit1在食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生EMT中的作用及其分子機(jī)制，以期可以為 Bit1過表達(dá)可促進(jìn)食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移提供佐證，同時(shí)也可為發(fā)現(xiàn)ECSS臨床轉(zhuǎn)移及其預(yù)后評(píng)價(jià)的分子標(biāo)志物提供新思路。
　　方法：
　　1.siRNA轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞與EC1細(xì)胞下調(diào)Bit1的表達(dá)，western blot檢測(cè)Bit1、Bcl-2、Bax、CDK4、Snail、E-cadherin、N-cadher

6、in蛋白表達(dá)水平的變化。
　　2.通過三次Transwell實(shí)驗(yàn)篩選具有侵襲力強(qiáng)的細(xì)胞亞系 EC9706-I3并與親本細(xì)胞EC9706-I0進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生物學(xué)行為的比較。
　　2.1.形態(tài)觀察EC9706-I3細(xì)胞并與其親本細(xì)胞EC9706-I0進(jìn)行比較。
　　2.2.CCK-8檢測(cè)兩種細(xì)胞的增殖能力。
　　2.3.劃痕實(shí)驗(yàn)比較二者的遷移能力。
　　2.4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)二者細(xì)胞周期的不同。
　　2.

7、5.Western blot檢測(cè)二者Bit1、Snail、N-cadherin蛋白水平的變化。
　　3.TGF-β1誘導(dǎo)EC9706細(xì)胞建立上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化模型并檢測(cè)Bit1在其中的作用。
　　3.1.形態(tài)觀察TGF-β1不同濃度梯度（0、5、10、15、20、25ng/ml）作用下EC9706細(xì)胞形態(tài)變化。
　　3.2.Western blot檢測(cè)TGF-β1不同濃度梯度誘導(dǎo)下Bit1、Snail、N-cadherin蛋

8、白表達(dá)的變化從而確定TGF-β1的最佳誘導(dǎo)濃度。
　　3.3.以最佳濃度誘導(dǎo)EC9706發(fā)生EMT后siRNA下調(diào)Bit1的表達(dá)，觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　3.4.TGF-β1誘導(dǎo)EC9706發(fā)生EMT后下調(diào)Bit1的表達(dá)，western blot檢測(cè)Bit1、Snail、N-cadherin蛋白水平的變化。
　　4.Western blot初步驗(yàn)證前期基因芯片所篩選的Bit1下游效應(yīng)分子（Paxillin、FAK）。

9、
　　4.1.Western blot檢測(cè)EC9706-I0與EC9706-I3細(xì)胞中Paxillin、p-Paxillin、FAK、p-FAK蛋白表達(dá)的變化。
　　4.2.Western blot檢測(cè)不同濃度TGF-β1誘導(dǎo)下EC9706細(xì)胞中Paxillin、FAK、p-FAK蛋白表達(dá)的變化。
　　4.3.以最佳濃度誘導(dǎo)EC9706細(xì)胞后siRNA下調(diào)Bit1表達(dá)，western blot檢測(cè)Paxillin、FA

10、K、p-FAK蛋白表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果：
　　1.Bit1-siRNA可下調(diào)EC9706與EC1細(xì)胞中Bit1的表達(dá)，干擾效率可達(dá)66％；其中E-cadherin、Bax、CDK4的表達(dá)隨著Bit1的降低而升高，而Bcl-2、Snail、N-cadherin的表達(dá)隨著Bit1的下調(diào)而下調(diào)（均P<0.05）。
　　2.三次Transwell實(shí)驗(yàn)篩選之后EC9706-I3細(xì)胞亞系與其親本細(xì)胞EC9706-I0相比：（

11、1）EC9706-I3形態(tài)變長、有偽足、細(xì)胞之間疏散；（2）EC9706-I3在24h、48h、72h的增殖能力均強(qiáng)于其親本細(xì)胞EC9706-I0（P<0.001）；（3）EC9706-I3的遷移能力強(qiáng)于其親本細(xì)胞EC9706-I0（P<0.05）；（4）EC9706-I3細(xì)胞的S期（ DNA合成期）相對(duì)于親本細(xì)胞有所延長并且 EC9706-I3的增殖指數(shù)較大（P<0.05）；（5）EC9706-I3細(xì)胞中Bit1的表達(dá)量明顯升高且和N

12、-cadherin、Snail的表達(dá)呈正相關(guān)（均P<0.05）。
　　3.TGF-β1誘導(dǎo)EC9706細(xì)胞建立上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化模型并檢測(cè)Bit1在其中的作用：（1）TGF-β1濃度為5-15ng/ml之間細(xì)胞形態(tài)變長，以10ng/ml時(shí)最為顯著，20-25ng/ml時(shí)細(xì)胞形態(tài)逐漸接近正常形態(tài)；（2）Western blot結(jié)果顯示TGF-β1為10ng/ml時(shí)Bit1、Snail、E-cadherin蛋白的表達(dá)量最高（均P<0.05）

13、；（3）10ng/ml TGF-β1誘導(dǎo)EC9706發(fā)生EMT之后再用Bit1-siRNA下調(diào)Bit1的表達(dá)后，細(xì)胞形態(tài)逐漸變圓，脫落較多；（4）EC9706發(fā)生EMT之后下調(diào)Bit1的表達(dá)， N-cadherin、Snail蛋白的表達(dá)與Bit1呈正相關(guān)（均P<0.05）。
　　4.Western blot初步驗(yàn)證前期基因芯片所篩選的Bit1下游效應(yīng)分子（Paxillin、FAK）：（1）Western blot結(jié)果顯示EC970

14、6-I0與EC9706-I3細(xì)胞中Paxillin、p-Paxillin、FAK、p-FAK蛋白的表達(dá)均與 Bit1的表達(dá)正相關(guān)（均 P<0.05）；（2）TGF-β1誘導(dǎo)濃度為10ng/ml時(shí)，EC9706細(xì)胞中Paxillin、FAK、p-FAK蛋白的表達(dá)量最高且與Bit1表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系（均P<0.05）；（4）TGF-β1誘導(dǎo)之后下調(diào)Bit1的表達(dá)，Paxillin、FAK、p-FAK的表達(dá)也隨之下降且與Bit1表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系