STAT3對缺氧誘導(dǎo)食管鱗癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用.pdf

1、背景：
　　缺氧微環(huán)境和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移、凋亡抵抗和耐藥有著密切的關(guān)系。EMT是缺氧誘發(fā)食管鱗癌生長和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of Transcription，STAT3）是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要轉(zhuǎn)錄因子，磷酸化活化的STAT3，與缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxi

2、a inducible factor-1α，HIF-1α）協(xié)同作用，調(diào)控細(xì)胞缺氧效應(yīng)，參與腫瘤惡性轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移等進(jìn)程。STAT3是否參與食管鱗癌缺氧誘導(dǎo)的EMT調(diào)控？其中有著怎樣的臨床意義？目前尚未見報(bào)道。本研究將著力解決這些問題。
　　第一部分食管鱗癌組織pSTAT3、HIF-1α表達(dá)與EMT的關(guān)系及臨床意義
　　目的：
　　研究磷酸化STAT3(pSTAT3)、HIF-1α和E-cadherin三者的關(guān)系，及其對食管

3、鱗癌臨床特征和預(yù)后的影響。
　　方法：
　　收集食管鱗癌根治切除標(biāo)本106例，免疫組化檢測目標(biāo)蛋白的表達(dá)，記錄患者復(fù)發(fā)及生存時(shí)間。比較食管正常上皮與食管鱗癌 pSTAT3、HIF-1α和E-cadherin的表達(dá)，分析食管鱗癌組織三者表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，Kaplan-Meier法分析生存數(shù)據(jù)，Log-rank檢驗(yàn)和Cox回歸方法分析影響生存的因素。
　　結(jié)果：
　　1．pSTAT3的表達(dá)食管鱗癌[71.7％

4、（76/106）]較正常食管上皮[57.4%（58/101）]增加，HIF-1α的表達(dá)食管鱗癌[73.6%（78/106）]較正常食管上皮[60.4%（61/101）]增加，E-cadherin的表達(dá)食管鱗癌[40.6%（43/106）]較正常食管上皮[100%（101/101）]下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　2．食管鱗癌組織 pSTAT3與 HIF-1ɑ表達(dá)正相關(guān)（γ=0.21），pSTAT3與E-cadher

5、in負(fù)相關(guān)（γ=-0.20），HIF-1ɑ與E-cadherin負(fù)相關(guān)（γ=-0.18），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　3．平均隨訪40.12個(gè)月，平均無病生存（DFS）36.71（95%CI32.78~40.64）個(gè)月,平均總生存（OS）40.12（95%CI36.85~43.40）個(gè)月，多因素分析提示分期增加、pSTAT3陽性表達(dá)與不良 DFS和OS有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　第二部分缺氧

6、對食管鱗癌細(xì)胞EMT影響的研究
　　目的：
　　探明食管鱗癌中缺氧與EMT的關(guān)系，缺氧對STAT3表達(dá)的影響。
　　方法：
　　食管鱗癌細(xì)胞株TE-1及EC-1，CoCl2模擬缺氧環(huán)境，觀察細(xì)胞形態(tài)變化、劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell小室檢測細(xì)胞運(yùn)動和侵襲的變化，real time PCR檢測HIF-1ɑ、E-cadherin、vimentin和STAT3 mRNA，Western blot和免疫熒光檢測HIF-1

7、α、E-cadherin、vimentin、pSTAT3蛋白含量的變化。
　　結(jié)果：
　　1．缺氧狀態(tài)TE-1及EC-1形態(tài)發(fā)生間質(zhì)樣改變；
　　2． EC-1細(xì)胞缺氧及常氧12 h遷移率分別為（35.14±1.45）%和（13.12±3.25）%，TE-1細(xì)胞分別為（30.65±1.91）%和（14.51±2.17）%；EC-1細(xì)胞缺氧及常氧12 h侵襲率分別為（318.26±40.83）%和100%，TE-1細(xì)胞分

8、別為（300.56±16.83）%和100%：缺氧條件下的細(xì)胞遷移率和侵襲率與常氧條件相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　3．E-cadherin mRNA缺氧較常氧降低[缺氧和常氧24 h相對mRNA EC-1細(xì)胞分別為0.02(范圍0.01~0.03)和1，TE-1細(xì)胞分別為0.02(范圍0.01~0.02)和1]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）； vimentin mRNA缺氧較常氧增高[缺氧和常氧24 h相對

9、mRNA EC-1細(xì)胞分別為37.07(范圍35.13~39.12)和1，TE-1細(xì)胞分別為7.34(范圍5.42~9.94)和1]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；STAT3 mRNA缺氧較常氧增高[缺氧和常氧24 h相對mRNA EC-1細(xì)胞分別為31.48(范圍25.90~38.26)和1，TE-1細(xì)胞分別為17.60(范圍14.68~21.12)和1]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；HIF-1α mRNA變化不一[缺氧和常

10、氧24 h相對mRNA EC-1細(xì)胞分別為1.38(范圍1.36~1.41)和1（P=0.01），TE-1細(xì)胞分別為0.79(范圍0.76~0.82)和1（P=0.14）]；
　　4．缺氧較常氧 E-cadherin蛋白表達(dá)下降[缺氧和常氧24 h相對蛋白量EC-1細(xì)胞分別為（0.77±0.07）和1，TE-1細(xì)胞分別為（0.55±0.05）和1]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；缺氧較常氧vimentin蛋白表達(dá)升高[缺氧和常

11、氧24 h相對蛋白量EC-1細(xì)胞分別為（1.74±0.08）和1，TE-1細(xì)胞分別為（1.86±0.35）和1]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；缺氧較常氧 HIF-1α蛋白表達(dá)升高[缺氧和常氧24 h相對蛋白量EC-1細(xì)胞分別為（2.67±0.37）和1，TE-1細(xì)胞分別為（2.79±0.25）和1]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；缺氧較常氧 pSTAT3蛋白表達(dá)升高[缺氧和常氧24 h相對蛋白量EC-1細(xì)胞分別為（2.45±0

12、.29）和1，TE-1細(xì)胞分別為（1.38±0.22）和1]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　第三部分干擾STAT3對缺氧誘導(dǎo)的食管鱗癌EMT的影響及機(jī)制
　　目的：
　　研究STAT3對于缺氧誘導(dǎo)的食管鱗癌EMT的調(diào)節(jié)作用及具體機(jī)制。
　　方法：
　　構(gòu)建STAT3 siRNA質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染EC-1細(xì)胞，觀察缺氧條件細(xì)胞形態(tài)變化，檢測細(xì)胞遷移和侵襲變化，HIF-1α、E-cadherin、viment

13、in蛋白和mRNA、STAT3 mRNA和pSTAT3蛋白的變化，ChIP方法檢測缺氧條件 STAT3與HIF-1α啟動子的結(jié)合。
　　結(jié)果
　　1．Western blot驗(yàn)證STAT3 siRNA有效抑制STAT3的表達(dá)；
　　2．對照、空載體、STAT3siRNA組常氧條件下遷移率分別（17.94±0.62）%、（16.28±0.21）%、（9.90±0.97）%，缺氧條件下遷移率分別是（33.82±1.42）%

14、、（35.90±1.51）%、（10.77±1.56）%，對照、空載體、STAT3siRNA組常氧條件下侵襲率分別為（100.00±0.00）%、（89.65±6.91）%、（33.60±4.17）%，缺氧條件下侵襲率分別為（276.08±19.88）%、（268.71±21.59）%、（109.95±11.96）%：STAT3siRNA明顯的抑制了常氧和缺氧條件下食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　

15、3．常氧條件vimentin相對mRNA在STAT3 siRNA組和空白對照組分別為0.05(范圍0.04~0.06)和1，HIF-1α相對mRNA在STAT3 siRNA組和空白對照組分別為0.11(范圍0.09~0.13)和1，E-cadherin相對mRNA在STAT3 siRNA組和空白對照組分別為4.43(范圍4.18~4.70)和1；缺氧條件vimentin相對mRNA在STAT3 siRNA組和空白對照組分別為0.31（范

16、圍0.23~0.42）和32.25（范圍30.48~34.13），HIF-1α相對mRNA在STAT3 siRNA組和空白對照組分別為0.14（范圍0.12~0.15）和1.22(范圍1.15~1.29)，E-cadherin相對 mRNA在 STAT3 siRNA組和空白對照組分別為4.06（范圍3.56~4.63）和0.06（范圍0.05~0.07）：常氧和缺氧條件，STAT3 siRNA明顯抑制vimentin、HIF-1αmRN

17、A的表達(dá)，增高E-cadherin mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　4．常氧條件pSTAT3相對蛋白含量在STAT3 siRNA組和空白對照組分別為0.49±0.06和1，HIF-1α分別為0.68±0.06和1，vimentin分別為0.78±0.07和1，E-cadherin分別為3.21±0.16和1；缺氧條件 pSTAT3相對蛋白含量在STAT3 siRNA組和空白對照組分別為0.97±0.09和1

18、.46±0.11；HIF-1α分別為1.01±0.07和1.32±0.06；vimentin分別為0.84±0.10和1.76±.015，E-cadherin分別為3.40±0.37和0.81±0.03：常氧和缺氧條件，STAT3 siRNA明顯抑制pSTAT3、HIF-1α、vimentin蛋白的表達(dá)，增高 E-cadherin蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　5．ChIP提示STAT3與HIF-1α啟動子的結(jié)

19、合。
　　第四部分體內(nèi)抑制STAT3對食管鱗癌移植瘤HIF-1α表達(dá)及EMT的影響
　　目的：
　　研究食管鱗癌腫瘤體內(nèi)缺氧的改變及 EMT變化，STAT3 siRNA在體內(nèi)對缺氧誘導(dǎo)的食管鱗癌EMT的影響。
　　方法：
　　建立 EC-1食管鱗癌裸鼠移植瘤模型，尾靜脈注射的方法分別給予 STAT3 siRNA及對照治療，觀察腫瘤的生長狀況，檢測不同組別移植瘤 STAT3、pSTAT3、HIF-1α和E-c

20、adherin的表達(dá)
　　結(jié)果：
　　1．生理鹽水對照組、空白載體對照組和STAT3 siRNA治療組移植瘤的平均大小分別為（2.97±0.21）×103mm3、（2.80±0.39）×103mm3、（2.21±0.40）×103mm3，STAT3 siRNA治療組較生理鹽水對照組和空白載體對照組腫瘤明顯縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；
　　2． STAT3 siRNA治療組腫瘤組織表達(dá) STAT3、pSTAT

21、3、HIF-1α、vimentin下降，表達(dá)E-cadherin增加。
　　結(jié)論
　　1．食管鱗癌 pSTAT3、HIF-1α表達(dá)較正常食管上皮升高，E-cadherin表達(dá)較正常食管上皮下降，三者表達(dá)具有相關(guān)性，pSTAT3陽性預(yù)示食管鱗癌預(yù)后不良。
　　2．缺氧促使STAT3表達(dá)上調(diào)，食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生EMT，細(xì)胞遷移和侵襲性增強(qiáng)。
　　3．STAT3經(jīng)由HIF-1α調(diào)控缺氧誘導(dǎo)的食管鱗癌EMT：抑制STAT3