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文檔簡介
1、目的:雙鏈RNA(Double-stranded RNA,dsRNA)在干擾素(Interferon,IFN)的產(chǎn)生、干擾素發(fā)揮作用以及抗病毒固有免疫中發(fā)揮著至關重要的作用。腺苷脫氨酶ADAR1(Adenosine Deaminase Acting on RNA1)由于其作用于雙鏈RNA的編輯作用而被廣泛關注。ADAR1作用于dsRNA,催化雙鏈結構RNA的腺苷(adenosine)發(fā)生脫氨基而變成肌苷(inosine),使得dsRNA
2、結構變得不穩(wěn)定,因此病毒及細胞內的RNA都能被ADAR1所作用編輯。近年來的研究主要集中在 ADAR1如何通過抑制干擾素通路上下游的一些因子而抑制干擾素的產(chǎn)生或抑制其發(fā)揮作用,從而起到負調控干擾素抗病毒的作用,或者研究ADAR1對不同病毒起到不同調控作用的機制。然而對于干擾素是否以及如何調控ADAR1的機制還不清楚。本課題擬研究IFNα對ADAR1-p110的泛素化水平和蛋白水平的調控機制,以及該調控對于IFNα抗病毒效應的影響。這一研
3、究旨在進一步理解干擾素有效抗病毒信號中新的調控機制,并為臨床上增強干擾素抗病毒治療新藥的研發(fā)提供潛在的新靶點。
方法:用 IFNα處理 HEK293T細胞以及過表達 Flag-ADAR1-p110的HEK293T細胞,用免疫印跡檢測IFNα對內、外源性ADAR1-p110蛋白水平的影響。進一步檢測IFNα對ADAR1-p110蛋白的影響是否依賴于泛素化。接下來鑒定ADAR1-p110泛素化過程中的E3連接酶,以及IFNα對AD
4、AR1-p110與其E3相互作用的影響。最后用免疫印跡及流式細胞計數(shù)檢測IFNα對ADAR1-p110的降解對IFNα有效抗VSV病毒效應的影響。
結果:⑴ADAR1-p110抑制了IFNα介導的抗病毒功能。⑵IFNα能夠誘導ADAR1-p110的降解,并且具有時間和劑量依賴效應。⑶IFNα誘導了ADAR1-p110的泛素化增加,并且具有劑量依賴效應,且IFNα誘導了ADAR1-p110發(fā)生48位賴氨酸(K48)泛素化修飾,而
5、63位賴氨酸(K63)泛素化修飾水平則無明顯變化。⑷SCFβ-TrCP是ADAR1的E3連接酶,且ADAR1-p110上的“DSG(XX)n+2S”序列在β-TrCP對其特異性識別中發(fā)揮了關鍵作用。⑸IFNα誘導ADAR1-p110的泛素化依賴于β-TrCP,IFNα能夠增強兩者的相互作用。⑹ADAR1-p110序列上的第574和576位賴氨酸是 IFNα誘導ADAR1-p110發(fā)生泛素化的主要泛素結合位點。⑺IFNα對ADAR1-p1
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