柑橘CitR2R3MYBs家族基因的克隆及初步功能分析.pdf

1、MYB是植物體內(nèi)成員最多、功能最廣的轉(zhuǎn)錄因子之一，通常根據(jù)MYB家族與目標(biāo)基因啟動子DNA序列結(jié)合的保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，將其分成4類，其中R2R3MYB是最大的亞家族。對擬南芥、水稻等模式植物研究表明R2R3MYBs轉(zhuǎn)錄因子參與了植物多方面的生理生化過程，例如表皮細(xì)胞的分化，次生代謝物質(zhì)的調(diào)控，細(xì)胞周期的控制，腋芽分生組織的形成，柱頭和花藥的發(fā)育以及對各種逆境的響應(yīng)和防御等。但有關(guān)R2R3MYBs轉(zhuǎn)錄因子在柑橘上的研究卻鮮有報道。隨著柑橘

2、基因組測序的完成以及數(shù)據(jù)庫的建立，為進(jìn)一步開展柑橘R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子的全基因組分析提供了良好條件。
　　‘資陽’香橙(Citrus junos‘ziyang’)因其高抗堿性、抗病和優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)等優(yōu)良特性，已成為柑橘，特別是雜柑栽培的常用作砧木。本文參考柑橘基因組信息，以‘資陽’香橙為材料，鑒定了R2R3MYBs基因的數(shù)量及其在基因組上的分布，并結(jié)合聚類分析和實時熒光定量PCR技術(shù)對其進(jìn)行表達(dá)譜分析,最終篩選鑒定一個與抗鹽相關(guān)的R2

3、R3MYB基因，并對其進(jìn)行了克隆、過表達(dá)載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化煙草初探其功能。該研究旨在為利用基因工程技術(shù)改進(jìn)柑橘品種抗逆性提供重要的功能基因，不僅具有重要的理論意義，還具有潛在的重要生產(chǎn)應(yīng)用價值。主要研究結(jié)果如下:
　　1.本研究利用擬南芥R2R3MYB氨基酸序列，在柑橘數(shù)據(jù)庫查找所有的MYB數(shù)據(jù)，然后利用PROSITE和SMART軟件分析這些MYB的特征結(jié)構(gòu)域，并在柑橘(Citrus sinesis和Citrus clementina

4、)基因組上鑒定了101個R2R3MYB基因，其數(shù)量幾乎與水稻中R2R3MYB基因的數(shù)量是幾乎相等的。通過構(gòu)建進(jìn)化樹可以把這101個R2R3MYB基因分成21個亞族。分析其進(jìn)化關(guān)系和外顯子-內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)特征，顯示R2R3MYB基因具有高度保守性和長期演化過程中形成的特別功能基因。半定量分析101個R2R3MYB基因在香橙根、葉片、花和幼果不同組織的特異性表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)95個R2R3MYB基因至少在一個組織中高表達(dá)，其余6個基因則在所有的被

5、檢測的組織中其表達(dá)量極低，由此推測R2R3MYB基因在柑橘組織生長發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。實時表達(dá)分析 R2R3MYB基因在多種非生物脅迫(NaCl，ABA，甲基茉莉酸，干旱和低溫)下的表達(dá)豐度，結(jié)果顯示多數(shù)R2R3MYB基因可響應(yīng)一種或多種脅迫處理，這為提高柑橘適應(yīng)非生物逆境脅迫能力的分子標(biāo)記育種提供了理論基礎(chǔ)。
　　2.從‘資陽’香橙中分離、克隆了一個可能參與柑橘逆境脅迫的R2R3MYB基因，即CitMYB40，其開放閱

6、讀框（ORF）為1047 bp，推測為可編碼348個氨基酸殘基的多肽。以CitMYB40基因組序列與cDNA比對的結(jié)果表明CitMYB40含有2個內(nèi)含子，氨基酸結(jié)構(gòu)分析表明CitMYB40是MYB類轉(zhuǎn)錄因子家族中成員數(shù)最多的R2R3MYB亞家族。通過進(jìn)化樹分析，CitMYB40與擬南芥參與逆境響應(yīng)的R2R3MYB亞家族成員AtMYB74同源性最高，相似度達(dá)到80％，預(yù)示了CitMYB40基因也可能參與了植物滲透性脅迫。
　　3.為

7、初步探究CitMYB40基因的功能，構(gòu)建了p35S:CitMYB40-GFP表達(dá)載體，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，CitMYB40蛋白定位于細(xì)胞核中。構(gòu)建CitMYB40-pBI121過表達(dá)載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化W38煙草，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草對高鹽脅迫表現(xiàn)出明顯的差異；CitMYB40基因在煙草中的過表達(dá)，也能夠改變與逆境相關(guān)基因（NtCBF1、NtERD10C等）的表達(dá)，為進(jìn)一步研究CitMYB40基因在柑橘組織中的抗逆功能奠定基礎(chǔ)。