MicroRNA-145介導(dǎo)OCT4表達以促進子宮內(nèi)膜癌細胞分化的機制研究.pdf

1、子宮內(nèi)膜癌(Endometrial Carcinoma)是女性生殖道常見的三大惡性腫瘤之一,嚴重影響了廣大女性的生殖健康和生活質(zhì)量,且近年來由于環(huán)境因素的變化和女性激素的濫用,其發(fā)病率呈顯著上升趨勢。影響子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的因素諸多,其中以腫瘤細胞的分化程度尤為重要。細胞的分化越差,則患者的預(yù)后越差。腫瘤細胞與其來源的細胞相比,主要表現(xiàn)為低分化和高度增殖的特性,分化程度越低,細胞增殖越快,腫瘤的惡性程度越高；而分化程度高的腫瘤則接近正常組織

2、,生長緩慢且預(yù)后好。既然分化障礙與惡性腫瘤的形成密切相關(guān),那么誘導(dǎo)腫瘤細胞向正常細胞分化,從而達到治療甚至治愈腫瘤的目的,就成為眾多學(xué)者的研究方向。但迄今為止,除高效孕激素可用于孕激素受體陽性的高分化子宮內(nèi)膜癌外,其它有效的可用于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或低分化癌的誘導(dǎo)分化劑還未見報道。
　　 大量的研究表明,腫瘤干細胞樣細胞(Cancer stem cell-like cells,CSCLCs)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。干細胞研

3、究在過去十年的飛速發(fā)展促進了腫瘤干細胞學(xué)說的發(fā)展。有學(xué)者認為腫瘤組織主要由三種細胞組成:1、具有無限增殖能力和形成新的腫瘤克隆的腫瘤細胞,即所謂的“腫瘤干細胞”；2、具有有限增殖能力但不能形成新的腫瘤克隆的細胞；3、喪失了上述兩種能力的腫瘤細胞。其中腫瘤干細胞雖占少數(shù),但由于其具有自我更新、無限增殖和多向分化潛能等干細胞特性,成為腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的根源。維持干細胞多能性的關(guān)鍵因子OCT4在處于未分化狀態(tài)的CSCLCs中呈高表達,在由

4、不同分化狀態(tài)細胞組成的腫瘤組織中表達明顯降低,而上調(diào)OCT4可使干細胞維持其自我更新和無限增殖的能力。這說明OCT4與腫瘤細胞的分化狀態(tài)密切相關(guān)。抑制OCT4的表達有可能誘導(dǎo)腫瘤細胞分化。并且已有學(xué)者證實,體外培養(yǎng)的腫瘤細胞株具有腫瘤干細胞樣細胞的特性,而裸鼠移植瘤內(nèi)的細胞則由于體內(nèi)微環(huán)境的變化而呈現(xiàn)出不同的分化狀態(tài)。
　　 MicroRNAs(miRNAs)是一類小RNA分子,能以不完全互補的方式與其靶mRNA的3’非翻譯端的

5、特定區(qū)域相互作用,引起mRNA的切割降解,蛋白翻譯抑制,進而影響靶基因的表達和作用。大量研究表明miRNA表達的變化與人類多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。但何種miRNA能作用于靶基因進而促進腫瘤細胞向正常細胞分化,以達到治療腫瘤的目的尚未見相關(guān)報道。MicroRNA-145(miR-145)在生殖細胞系以及中胚層來源的組織中呈高表達。因此miR-145在中胚層來源的子宮內(nèi)膜組織的細胞分化中很有可能起到了關(guān)鍵作用。已有研究證明,在胚胎干細

6、胞中OCT4作為miR-145的靶基因,受其抑制,引起胚胎干細胞向類胚體的各胚層細胞分化。由此本研究設(shè)想是否miR-145在腫瘤細胞中也可通過調(diào)控信號分子OCT4的表達,促進腫瘤細胞向正常細胞轉(zhuǎn)化呢?
　　 基于以上發(fā)現(xiàn),本研究通過以下三部分進行探索:
　　 1、利用體外培養(yǎng)的Ishikawa細胞以及裸鼠移植瘤模型檢測了不同分化狀態(tài)下miR-145和OCT4的表達及相互作用關(guān)系。
　　 2、利用功能獲得和功能缺失

7、實驗證實上調(diào)miR-145可通過抑制OCT4的表達促進腫瘤細胞分化。
　　 3、檢測高、低分化子宮內(nèi)膜癌組織中miR-145和OCT4的表達情況。為尋找一種嶄新的腫瘤治療途徑,從而提高子宮內(nèi)膜癌患者的生存率和治愈率提供新的思路。
　　 目的:檢測miR-145和OCT4在體外培養(yǎng)的Ishikawa細胞以及Ishikawa裸鼠移植瘤中的表達情況和作用關(guān)系。
　　 方法:利用實時定量PCR(real-time PCR

8、)和流式細胞技術(shù)測定體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞株和裸鼠移植瘤中miR-145和OCT4的表達變化,找出它們相互間的變化規(guī)律；并利用熒光素酶報道基因的方法,證明在Ishikawa細胞中miR-145是否直接作用于信號分子OCT4的3’非翻譯區(qū)(3’UTR),進而影響OCT4的表達；應(yīng)用實時定量PCR和流式細胞技術(shù),證實miR-145是否通過蛋白翻譯抑制來影響OCT4的表達。
　　 結(jié)果:
　　 1、體外培養(yǎng)的

9、Ishikawa細胞中OCT4在mRNA和蛋白水平均呈高表達,流式細胞分析顯示與ISO type同型對照相比,OCT4陽性細胞高達90％,而在Ishikawa裸鼠移植瘤中OCT4的表達雖可檢測到,但與培養(yǎng)細胞相比明顯降低,流式細胞分析中OCT4陽性率僅為5％。與OCT4情況相反,miR-145在培養(yǎng)細胞中的表達明顯低于在移植瘤中的表達。
　　 2、與陰性對照及miR-Scramble(miR-SC)相比,miR-145成熟體(m

10、iR-145mimics)和OCT43’UTR共轉(zhuǎn)染Ishikawa細胞能明顯降低報告質(zhì)粒的熒光強度,差異具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),說明外源性的miR-145可直接作用于OCT4；同時對比了單獨轉(zhuǎn)染OCT43’UTR和未轉(zhuǎn)染OCT43’UTR的報告質(zhì)粒熒光強度變化,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染OCT43'UTR的報告質(zhì)粒熒光強度明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明內(nèi)源性的miR-145也可直接作用于OCT4。
　　 3、在轉(zhuǎn)

11、染miR-145 mimics入Ishikawa細胞48小時后,分別在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平來檢測OCT4的表達量。結(jié)果顯示OCT4的mRNA并未發(fā)生明顯變化,而其蛋白水平卻明顯下降(P<0.05)。
　　 結(jié)論:本研究首次發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中miR-145與干細胞因子OCT4的表達呈負相關(guān),并與腫瘤細胞的分化程度有關(guān)。外源或內(nèi)源性的miR-145均可作用于mRNA的3’UTR區(qū)來直接調(diào)控OCT4的表達并對細

12、胞的生長產(chǎn)生影響。miR-145是通過蛋白質(zhì)翻譯抑制來調(diào)控細胞內(nèi)OCT4的表達。
　　 目的:通過功能獲得和功能缺失實驗,利用子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞株和動物模型,展開miR-145通過調(diào)控OCT4表達來誘導(dǎo)腫瘤細胞分化的作用機制研究。以證明miR-145在體外和體內(nèi)均可通過抑制OCT4的表達誘導(dǎo)腫瘤細胞分化。為選擇新的腫瘤細胞誘導(dǎo)分化劑提供了新的思路和方法。
　　 方法:
　　 1、利用瞬時轉(zhuǎn)染、流式細胞

13、技術(shù)測定體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞在轉(zhuǎn)染miR-145 mimics和miR-145抑制劑(miR-145 inhibitor)48小時后細胞內(nèi)OCT4的表達變化；利用瞬時轉(zhuǎn)染和real-time PCR技術(shù)觀察轉(zhuǎn)染OCT4的小RNA干擾劑(siRNA OCT4)48小時后,細胞內(nèi)miR-145的變化。
　　 2、利用westernblot和real-time PCR技術(shù)觀察了細胞轉(zhuǎn)染miR-145 mimics,

14、inhibitor以及siRNA OCT472小時后,子宮內(nèi)膜癌細胞分化標記物glycodelin的變化。
　　 3、利用以慢病毒為載體的miR-145(lenti-miR-145)穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株觀察了miR-145在體內(nèi)對OCT4的作用。
　　 結(jié)果:
　　 1、轉(zhuǎn)染miR-145 mimics48小時后,與miR-SC相比,顯著地下調(diào)了細胞OCT4的表達(P<0.05)。轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitor48

15、小時后,細胞OCT4水平比SC對照組明顯升高(P<0.05)。與其SC對照和空白對照相比,siRNA OCT4轉(zhuǎn)入Ishikawa細胞48小時后,細胞內(nèi)miR-145的水平明顯上調(diào),而OCT4的水平明顯下降。(P<0.05)
　　 2、在分別轉(zhuǎn)染miR-145mimic、miR-145 inhibitor和siRNA OCT4以及它們的SC對照入Ishikawa細胞72小時后,與其SC以及空白對照相比,glycodelin的表達

16、水平在miR-145 mimics和siRNA OCT4組顯著上調(diào),而在miR-145 inhibitor組明顯下降(P<0.05)。
　　 3、體內(nèi)試驗中(in vivo),與SC對照和空白對照組相比,lenti-miR-145組OCT4的表達明顯下調(diào),而glycodelin的表達明顯上調(diào)(P<0.05)。Lenti-miR-145明顯抑制了腫瘤的生長,但并未阻止腫瘤的生長。
　　 結(jié)論:
　　 1、在Ishi

17、kawa細胞中,miR-145的過表達可抑制OCT4的表達水平,而OCT4對miR-145也有負反饋作用。
　　 2、miR-145通過抑制OCT4的表達促進了子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞分化,而抑制OCT4表達使內(nèi)源性miR-145上調(diào)同樣可促進腫瘤細胞分化。
　　 3、在體內(nèi)miR-145同樣可抑.制OCT4的表達,促進腫瘤細胞分化,并抑制了腫瘤組織的增長。
　　 目的:證實腫瘤的分化程度與腫瘤組織內(nèi)miR

18、-145和OCT4的表達水平有相關(guān)性,進一步驗證miR-145的促進腫瘤細胞分化的作用。
　　 方法:利用real-timePCR、流式細胞技術(shù)以及HE染色和免疫組化方法,檢測高分化和低分化人體子宮內(nèi)膜癌組織中miR-145及OCT4的表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、miR-145在正常內(nèi)膜組織和兩種癌組織中都能檢測到,但與高分化癌和正常內(nèi)膜相比,低分化癌組中的miR-145表達水平明顯降低(P<0.05)。

19、
　　 2、與miR-145相反,OCT4在正常內(nèi)膜組織中不表達,高分化癌中呈低表達,而在低分化癌中呈高表達(P<0.05)。
　　 結(jié)論:miR-145的表達與子宮內(nèi)膜癌患者腫瘤分化級別呈正相關(guān)。OCT4與腫瘤的分級呈負相關(guān)。OCT4和miR-145或可成為腫瘤分化程度的標識物,用于子宮內(nèi)膜癌的診斷。
　　 總之,本課題通過體內(nèi)、體外以及子宮內(nèi)膜癌實體腫瘤驗證三個部分,首次闡明在子宮內(nèi)膜癌細胞及組織中miR-1

20、45與干細胞因子OCT4之間存在著雙向負反饋關(guān)系。并利用子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞進行了miR-145與OCT4間體內(nèi)和體外相互干預(yù)效應(yīng)的實驗,從基因和蛋白水平,探討了miR-145作為OCT4的抑制因子,通過下調(diào)其表達而抑制腫瘤細胞無限增殖并進一步促進腫瘤細胞向接近正常子宮內(nèi)膜細胞分化的可能性。最后又在子宮內(nèi)膜癌患者的實體腫瘤中對miR-145和OCT4的表達變化與高、低分化子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系。為尋找新的誘導(dǎo)腫瘤細胞分化的治療方法提