MicroRNA-145通過介導(dǎo)OPG表達(dá)參與糖尿病慢性炎癥過程.pdf

1、第一部分糖尿病人群外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-145的表達(dá)差異研究
　　目的:分析2型糖尿病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-145以及外周血清中OPG的差異表達(dá)。
　　方法:應(yīng)用口服糖耐量實(shí)驗(yàn)社區(qū)篩查新診斷的2型糖尿病、IGT患者以及性別年齡相匹配的正常人群作為對(duì)照組，抽取外周血。應(yīng)用Real Time PCR的方式抽取外周血單個(gè)核細(xì)胞中的miR-145;應(yīng)用western blotting檢測(cè)血清中OPG表達(dá);應(yīng)用線性回歸法分

2、析miR-145和OPG的表達(dá)相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　1、2型糖尿病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-145的表達(dá)下調(diào);
　　2、2型糖尿病患者外周血清中OPG表達(dá)上調(diào);
　　3、miR-145的表達(dá)和OPG的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)向相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)論:2型糖尿病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-145表達(dá)下調(diào)，外周血清中OPG表達(dá)上調(diào)。
　　第二部分miR-145慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
　　目的:構(gòu)建及鑒

3、定miR-145慢病毒表達(dá)載體，包裝純化慢病毒顆粒，檢測(cè)慢病毒體外感染的表達(dá)情況及效率。
　　方法:利用Real Time PCR的方法，合成miR-145序列，克隆到載體中，并利用載體引物進(jìn)行測(cè)序;取PCR鑒定陽性的克隆，用QIAGEN plasmid mini kit提質(zhì)粒，對(duì)含目的片段的陽性重組克隆進(jìn)行全序列測(cè)定，并對(duì)測(cè)序結(jié)果使用NCBI(National Center for Biotechnology Informati

4、on)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì);對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行線性化處理:雙酶切表達(dá)載體質(zhì)粒DNA，切膠回收酶切產(chǎn)物以及對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行濃度純度鑒定;將重組質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染人胚胎腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞后包裝出高滴度的慢病毒顆粒。使用經(jīng)過滴度檢測(cè)的慢病毒，進(jìn)行細(xì)胞感染預(yù)實(shí)驗(yàn)，求得最佳的病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)值。將攜帶miR-145的融合EGFP基因的重組慢病毒再次感染293T細(xì)胞，檢測(cè)標(biāo)志蛋白增強(qiáng)型綠色熒光蛋白和應(yīng)用Real Time-PCR檢測(cè)miR-

5、145的表達(dá)量以及應(yīng)用Western blotting檢測(cè)miR-145的靶基因OPG的表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證重組慢病毒在細(xì)胞中的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、從小鼠胚胎細(xì)胞NIH3T3中提取總DNA，瓊脂糖凝膠電泳見基因組DNA條帶清晰，無明顯降解確。經(jīng)PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳，可見606bp大小的陽性條帶。菌落PCR擴(kuò)增后電泳，可見目的條帶(689bp)長度所處位置正確。提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與miR-145的小鼠基因組標(biāo)

6、準(zhǔn)序列完全一致;
　　2、重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，測(cè)序結(jié)果顯示插入序列與目標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)序列一致;重組質(zhì)粒中攜帶有正確的miR-145，并能轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，產(chǎn)生重組病毒，經(jīng)純化濃縮后慢病毒滴度高達(dá)1.9×104ifu/ul;
　　3、目的基因miR-145能被重組慢病毒高效地轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞后24小時(shí)即可見到綠色熒光蛋白表達(dá)，以后逐漸增強(qiáng)，72小時(shí)可見到較強(qiáng)的EGFP表達(dá)，之后表達(dá)趨于穩(wěn)定;
　　4、檢測(cè)被感染的293T細(xì)胞，