MicroRNA-145通過介導OPG表達參與糖尿病慢性炎癥過程.pdf

1、第一部分糖尿病人群外周血單個核細胞中miR-145的表達差異研究
　　目的:分析2型糖尿病患者外周血單個核細胞中miR-145以及外周血清中OPG的差異表達。
　　方法:應用口服糖耐量實驗社區(qū)篩查新診斷的2型糖尿病、IGT患者以及性別年齡相匹配的正常人群作為對照組，抽取外周血。應用Real Time PCR的方式抽取外周血單個核細胞中的miR-145;應用western blotting檢測血清中OPG表達;應用線性回歸法分

2、析miR-145和OPG的表達相關性。
　　結果:
　　1、2型糖尿病患者外周血單個核細胞中miR-145的表達下調;
　　2、2型糖尿病患者外周血清中OPG表達上調;
　　3、miR-145的表達和OPG的表達呈現(xiàn)負向相關關系。
　　結論:2型糖尿病患者外周血單個核細胞中miR-145表達下調，外周血清中OPG表達上調。
　　第二部分miR-145慢病毒表達載體的構建與鑒定
　　目的:構建及鑒

3、定miR-145慢病毒表達載體，包裝純化慢病毒顆粒，檢測慢病毒體外感染的表達情況及效率。
　　方法:利用Real Time PCR的方法，合成miR-145序列，克隆到載體中，并利用載體引物進行測序;取PCR鑒定陽性的克隆，用QIAGEN plasmid mini kit提質粒，對含目的片段的陽性重組克隆進行全序列測定，并對測序結果使用NCBI(National Center for Biotechnology Informati

4、on)數(shù)據(jù)庫進行序列比對;對表達載體進行線性化處理:雙酶切表達載體質粒DNA，切膠回收酶切產(chǎn)物以及對酶切產(chǎn)物進行濃度純度鑒定;將重組質粒和包裝質粒共同轉染人胚胎腎上皮細胞系293T細胞后包裝出高滴度的慢病毒顆粒。使用經(jīng)過滴度檢測的慢病毒，進行細胞感染預實驗，求得最佳的病毒感染復數(shù)(MOI)值。將攜帶miR-145的融合EGFP基因的重組慢病毒再次感染293T細胞，檢測標志蛋白增強型綠色熒光蛋白和應用Real Time-PCR檢測miR-

5、145的表達量以及應用Western blotting檢測miR-145的靶基因OPG的表達，進一步驗證重組慢病毒在細胞中的表達。
　　結果:
　　1、從小鼠胚胎細胞NIH3T3中提取總DNA，瓊脂糖凝膠電泳見基因組DNA條帶清晰，無明顯降解確。經(jīng)PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳，可見606bp大小的陽性條帶。菌落PCR擴增后電泳，可見目的條帶(689bp)長度所處位置正確。提取質粒進行測序，測序結果與miR-145的小鼠基因組標

6、準序列完全一致;
　　2、重組質粒經(jīng)酶切鑒定，測序結果顯示插入序列與目標標準序列一致;重組質粒中攜帶有正確的miR-145，并能轉染293T細胞，產(chǎn)生重組病毒，經(jīng)純化濃縮后慢病毒滴度高達1.9×104ifu/ul;
　　3、目的基因miR-145能被重組慢病毒高效地轉染入293T細胞后24小時即可見到綠色熒光蛋白表達，以后逐漸增強，72小時可見到較強的EGFP表達，之后表達趨于穩(wěn)定;
　　4、檢測被感染的293T細胞，