ALA-PDT對(duì)白血病細(xì)胞及耐藥細(xì)胞的干預(yù)及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 急性白血病是威脅人類健康的常見血液腫瘤之一。目前化療仍是治療急性白血病的主要手段，而白血病細(xì)胞對(duì)于化療藥物產(chǎn)生耐藥性則是化療失敗和臨床復(fù)發(fā)的主要原因。干細(xì)胞移植是治療白血病的另一個(gè)主要手段，然而移植物中殘存的耐藥腫瘤細(xì)胞往往導(dǎo)致自體移植失敗或緩解后復(fù)發(fā)。因此探索新的克服、逆轉(zhuǎn)耐藥的方法非常重要。
　　 5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid，5-ALA)介導(dǎo)的光動(dòng)力治療(photody

2、namic therapy，PDT)是一種較新型的腫瘤治療手段，利用腫瘤細(xì)胞對(duì)ALA產(chǎn)生的內(nèi)源性光敏劑原卟啉Ⅸ(PpⅨ)的優(yōu)先攝取，使腫瘤細(xì)胞在受到一定的光照后被選擇性地殺傷。基于光動(dòng)力療法的凈化技術(shù)較其他凈化方法的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷，以最大程度地減少對(duì)正常前體細(xì)胞及干細(xì)胞的損傷。因此ALA-PDT在白血病自體移植物體外凈化中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。已有研究顯示ALA-PDT在白血病細(xì)胞中具有誘導(dǎo)凋亡作用，但到目前為止，ALA-

3、PDT引起腫瘤細(xì)胞破壞的確切機(jī)制尚未完全闡明。在白血病耐藥中的研究尚鮮見報(bào)道。
　　 本課題通過對(duì)ALA-PDT致白血病細(xì)胞及耐藥株凋亡的研究，將有助于深入了解ALA-PDT對(duì)白血病細(xì)胞增殖、凋亡及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)控，較全面的闡述ALA-PDT在白血病及耐藥中的潛在應(yīng)用價(jià)值，將為ALA-PDT這一新的治療手段最終應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.利用生長(zhǎng)曲線、MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖，對(duì)ALA的濃度

4、、孵育時(shí)間及光的能量密度等有關(guān)ALA-PDT實(shí)驗(yàn)條件選擇方面進(jìn)行初步探討。
　　 2.利用MTT法檢測(cè)ALA-PDT對(duì)HL-60及其耐藥株HL-60/ADR細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用瑞氏染色光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，采用磷脂結(jié)合蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)+碘化丙錠(PI)雙染法通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞的比例，并用共聚焦激光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)。
　　 3.采用陽離子脂質(zhì)熒光探針JC-1(5,5',6,6'-tetr

5、achloro-1,1',3,3'-tetraethyl-benzimidazol-carbocyanine iodide，四氯四乙基苯并咪唑羰花青)檢測(cè)ALA-PDT前后兩種細(xì)胞株線粒體跨膜電位的變化。
　　 4.半定量逆轉(zhuǎn)錄酶-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及Real time PCR檢測(cè)ALA-PDT對(duì)兩種細(xì)胞株Bcl-2 mRNA表達(dá)的調(diào)控，同時(shí)還檢測(cè)了ALA-PDT對(duì)HL-60/ADR細(xì)胞株中耐藥相關(guān)基因MRP mRNA表達(dá)的調(diào)控。<

6、br>　　 5.利用基因芯片技術(shù)，從全基因組水平研究ALA-PDT對(duì)HL-60及HL-60/ADR細(xì)胞基因表達(dá)譜變化，探討ALA-PDT對(duì)兩種細(xì)胞可能的作用機(jī)制。
　　 6.利用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖研究ALA-PDT在原代白血病細(xì)胞及正常單個(gè)核細(xì)胞(MNC)中的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.觀察ALA-PDT對(duì)HL-60及HL-60/ADR細(xì)胞株增殖的影響中最適實(shí)驗(yàn)條件為：ALA濃度1mM、避光孵育4h后，以

7、波長(zhǎng)630nm、能量密度為18J/cm2的光照射。
　　 2.ALA-PDT對(duì)兩種細(xì)胞增殖和凋亡的影響：ALA-PDT后兩種細(xì)胞株增殖均受到抑制，48h較24h更明顯。常規(guī)應(yīng)用瑞氏染色光鏡及透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，兩種細(xì)胞均發(fā)生了核固縮、凋亡小體等典型的凋亡改變；采用AnnexinV檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例隨時(shí)間延長(zhǎng)而隨之增加，HL-60細(xì)胞在ALA-PDT后4h凋亡細(xì)胞比例與對(duì)照組比較有顯著差異(P值＜0.05)；而HL-60/ADR細(xì)

8、胞在3h凋亡細(xì)胞比例與對(duì)照組比較有顯著差異(P值＜0.05)；在兩種細(xì)胞株間比較，僅在4h時(shí)HL-60細(xì)胞凋亡率顯著高于HL-60/ADR細(xì)胞(P值＜0.05)，而3h、24h比較兩種細(xì)胞株無顯著差異。在AnnexinV/FITC-PI染色后激光共聚集顯微鏡觀察到了典型的早期凋亡和晚期凋亡形態(tài)。兩種細(xì)胞株的單純ALA組、單純光照組與對(duì)照組比凋亡細(xì)胞比例均無顯著差異(P值＞0.05)。
　　 3.陽離子脂質(zhì)熒光探針JC-1顯示：A

9、LA-PDT后HL-60和HL-60/ADR兩種細(xì)胞株線粒體跨膜電位崩塌的細(xì)胞比例明顯升高，光照結(jié)束即刻(0h)分別升高至58.28％±0.92％和55.91％±2.60％，隨時(shí)間延長(zhǎng)，這種細(xì)胞比例逐步增多，呈一定的時(shí)間依賴性。顯示線粒體跨膜電位下降的發(fā)生早于形態(tài)學(xué)改變，也早于磷酯酰絲氨酸暴露于細(xì)胞表面。
　　 4.RT-PCR及Real time PCR均顯示：ALA-PDT能下調(diào)HL-60及HL-60/ADR細(xì)胞Bcl-2基

10、因的表達(dá)，而HL-60/ADR細(xì)胞耐藥相關(guān)基因MRP也有明顯下調(diào)。
　　 5.Illumina人全基因組芯片共檢測(cè)了48，000個(gè)基因，用RT-PCR的方法驗(yàn)證了數(shù)據(jù)的可靠性，對(duì)芯片結(jié)果產(chǎn)生的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：ALA-PDT影響了細(xì)胞的多種生命進(jìn)程，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控，抑制翻譯過程；促進(jìn)一系列應(yīng)激反應(yīng)；上調(diào)促凋亡基因的表達(dá)，抑制抗凋亡基因的表達(dá)，促進(jìn)凋亡的發(fā)生。
　　 6.正常骨髓MNC的ALA+PDT組在接受18J/cm2的光照劑

11、量時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯抑制。臍血MNC的ALA+PDT組在接受18～54J/cm2的光照劑量下，細(xì)胞存活率與對(duì)照組比較無顯著差異。ALA-PDT對(duì)急性白血病原代細(xì)胞顯示有不同程度的殺傷，初發(fā)和復(fù)發(fā)難治組光動(dòng)力效應(yīng)分別為53.40％±13.33％和62.42％±39.66％(24h)，64.11％±17.71％和68.78％±30.30％(48h)，初發(fā)和復(fù)發(fā)難治組比較無顯著差異。
　　 小結(jié)：
　　 1.ALA介導(dǎo)的PDT能

12、誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株HL-60及其耐藥株HL-60/ADR凋亡，呈一定的時(shí)間依賴性。
　　 2.ALA介導(dǎo)的PDT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可改變線粒體膜電位，下調(diào)Bcl2基因表達(dá)，膜電位的改變?cè)缬诩?xì)胞形態(tài)和磷酯酰絲氨酸暴露于細(xì)胞表面，提示凋亡與線粒體的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。
　　 3.ALA-PDT介導(dǎo)的HL-60/ADR細(xì)胞中耐藥基因CIAPIN1、MRP、Bcl2基因的下調(diào)，可能是ALA-PDT能逆轉(zhuǎn)/克服耐藥的因素之一。多藥耐藥細(xì)胞株

13、HL-60/ADR與ALA-PDT無交叉耐藥。
　　 4.多種調(diào)控機(jī)制參與凋亡的發(fā)生：HL-60/ADR細(xì)胞中線粒體途徑和Fas途徑的激活，主要是DEDD2及CDC2L2介導(dǎo)的凋亡通路占主要地位，其中FLASH、Bcl2、PAK1、E1B19K等基因參與其中促進(jìn)凋亡的發(fā)生。HL-60細(xì)胞中c-Abl、PML、C-MYC基因是上調(diào)基因網(wǎng)絡(luò)中的主導(dǎo)基因，共同參與了凋亡的發(fā)生。線粒體途徑和TNF途徑激活，DEDD2及CDC2L2介導(dǎo)的