ALA-PDT對(duì)人增生性疤痕成纖維細(xì)胞的作用.pdf

1、目的：成纖維細(xì)胞增殖和局部微血管異常增生是增生性疤痕的主要病理特征，現(xiàn)有非手術(shù)治療手段通常通過抑制成纖維細(xì)胞增殖或抑制血管增生達(dá)到治療目的。光動(dòng)力學(xué)治療已被證實(shí)在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、破壞局部血管網(wǎng)方面療效確實(shí)。因此，我們提出了應(yīng)用光動(dòng)力學(xué)治療增生性瘢痕的設(shè)想，探討了5-氨基酮戊酸（5-ALA）介導(dǎo)的光動(dòng)力治療（PDT）對(duì)體外培養(yǎng)的人增生性疤痕成纖維細(xì)胞的殺傷作用，為動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)及將來的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。 方法：①收集臨床增生性疤痕

2、和正常皮膚標(biāo)本，常規(guī)酶消化法分離獲得成纖維細(xì)胞，體外培養(yǎng)擴(kuò)增。取第4-6代成纖維細(xì)胞，在含有和不含有血清的培養(yǎng)液中添加ALA培養(yǎng)，孵育4小時(shí)后通過光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，激光共聚焦檢測細(xì)胞內(nèi)ALA代謝中間產(chǎn)物原卟啉IX（Protoporphyrin IX，PpIX）的積聚，并做熒光強(qiáng)度定量分析，探討ALA是否能被成纖維細(xì)胞吸收并產(chǎn)生PpIX的積聚，及培養(yǎng)液中血清對(duì)細(xì)胞內(nèi)PpIX積聚的影響。②用635nm波長的激光照射，總能量選擇10J/cm2

3、，功率密度選擇100mw/cm2、10mw/cm2,光鏡觀察治療前后細(xì)胞形態(tài)變化，MTT法檢測處理24小時(shí)后的細(xì)胞存活率，探討PDT對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞的殺傷作用。③采用相同的功率密度（100mw/cm2）不同的總能量（0-10 J/cm2）進(jìn)行照光處理，光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，TUNEL染色確認(rèn)細(xì)胞死亡方式，AnnexinV/PI雙染后流式細(xì)胞儀分析，檢測細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死的比率，探討不同照光條件對(duì)細(xì)胞殺傷的作用方式。 結(jié)果：⑴在無

4、血清培養(yǎng)條件下，ALA處理后4小時(shí)，成纖維細(xì)胞產(chǎn)生皺縮，而未處理組無明顯形態(tài)學(xué)變化；在有血清條件下，ALA處理組未處理組均未見明顯形態(tài)改變。激光共聚焦檢測可見ALA處理4小時(shí)后無血清培養(yǎng)組細(xì)胞內(nèi)有明顯的PpIX積聚，而有血清組PpIX的熒光強(qiáng)度較無血清組弱。⑵10J/cm2能量照光后，無血清培養(yǎng)條件，ALA處理組細(xì)胞24H內(nèi)漂浮壞死，MTT檢測生存率為11％-69％，與未用ALA處理組存在顯著差異。有血清條件下，ALA處理組與未處理組無

5、顯著差異。⑶在低能量2J/cm2-4J/cm2激光照射下，部分細(xì)胞TUNEL染色呈陽性，而在高能量照射時(shí)，細(xì)胞TUNEL染色呈陰性。AnnexinV/PI雙染后流式細(xì)胞儀分析顯示低能量激光照射時(shí)，約有3.6％-15.6％的細(xì)胞發(fā)生凋亡，而能量加大到10J/cm2時(shí)大部分細(xì)胞發(fā)生壞死。 結(jié)論：①人增生性疤痕成纖維細(xì)胞經(jīng)外源性ALA處理后，可產(chǎn)生PpIX的積聚，血清降低PpIX的積聚。②ALA-PDT對(duì)成纖維細(xì)胞有殺傷作用。③低能量