Perifosine的抗白血病作用及慢性粒細胞白血病細胞株對其耐藥機制的體外研究.pdf

1、第一部分：研究PRF對AML和CML細胞株的生長抑制及誘導凋亡的情況
　　 目的：
　　 研究和比較PRF對AML和CML細胞株的生長抑制作用及誘導凋亡的情況。從而為進一步研究PRF的抗白血病作用機制打下基礎。
　　 方法：
　　 MTT法檢測PRF對白血病細胞株的生長抑制作用，AV/PI流式細胞檢測術檢測PRF誘導白血病細胞株的凋亡情況，Hoechst染色法觀察PRF誘導白血病細胞凋亡的形態(tài)學改變，We

2、stern-blot法檢測PRF作用后caspase-3、caspase-9和PARP蛋白的表達變化，Western-blot法檢測白血病細胞株相關基因蛋白的表達情況。
　　 結果：
　　 (1)0～20μmol/L的PRF作用CML細胞株K562、K562/G以及AML細胞株Kasumi-1、HL-6024小時后，IC50分別是121.74、311.3、11.08、11.14μmol/L，作用48小時后IC50分別是5

3、6.28、141.75、4.24、3.62μmol/L。表明AML細胞株對PRF敏感，而CML細胞株則不敏感。(2)10μmol/L的PRF分別作用K562、K562/G、Kasumi-1和HL-60細胞株24小時后，AV/PI流式術檢測顯示凋亡率分別為8.23％、7.37％、26.72％、25.80％，表明PRF可顯著誘導AML細胞株凋亡，而對CML細胞株不敏感。(3)10μmol/L的PRF作用24H后，AML細胞株Kasumi-1

4、和HL-60的細胞核內(nèi)可見明顯的凋亡小體，而CML細胞株K562和K562/G中則未見凋亡小體，從形態(tài)學上證明PRF可以誘導AML細胞發(fā)生凋亡，但基本不誘導CML細胞凋亡。(4)PRF誘導AML細胞凋亡時，caspase-3、caspase-9、PARP蛋白激活，而CML細胞株的caspase-3、caspase-9、PARP則未見激活。(5)AML細胞株Kasumi-1和HL-60在經(jīng)PRF作用24小時后，AKT和P-AKT的表達有明

5、顯的下調(diào)，JNK和P-JNK可見明顯的上調(diào)，而對PRF不敏感的CML細胞株K562和K562/G中這些蛋白的表達水平無明顯變化。
　　 第二部分：研究CML細胞株對PRF耐藥的機制以及自噬在其中的作用
　　 目的：
　　 進一步研究CML細胞株K562和K562/G對PRF耐藥的潛在機制，以及自噬在其中的作用。從而為CML的治療提供更為有效的藥物打下基礎。
　　 方法：
　　 通過吖啶橙染色、透射

6、電鏡和LC3-GFP-K562熒光改變檢測PRF誘導CML細胞K562產(chǎn)生自噬，Western-blot法檢測PRF作用K562細胞后LC3及自噬相關蛋白的表達變化，MTT法檢測PRF聯(lián)合CQ對CML細胞株的生長抑制作用。
　　 結果：
　　 (1)PRF可以誘導CML細胞株發(fā)生自噬，且呈濃度依賴性。(2)PRF誘導CML細胞發(fā)生的自噬伴隨Atg-5的上調(diào)，卻未見Beclin-1和Atg-7的上調(diào)，為非Beclin-1依

7、賴性的。(3)PRF誘導CML細胞產(chǎn)生的自噬被抑制后，可以增強PRF對CML細胞的殺傷作用，表明該種自噬起保護性作用。
　　 結論：
　　 PRF可以下調(diào)Akt，顯著抑制AML細胞株Kasumi-1和HL-60生長并誘導凋亡，但對CML細胞株K562和K562/G則無此作用。PRF對CML耐藥可能與其誘導CML細胞產(chǎn)生保護性自噬有關，該種自噬為非Beclin-1依賴性的，抑制自噬可以增強PRF對CML細胞的殺傷作用，誘導