海生素對(duì)白血病細(xì)胞作用的初步研究.pdf

1、目的： 探討海生素對(duì)白血病細(xì)胞K562及其耐藥細(xì)胞K562/ADM體外增殖的抑制作用，對(duì)K562及K562/ADM細(xì)胞凋亡和K562細(xì)胞周期的影響，對(duì)K562/ADM細(xì)胞耐藥相關(guān)mdrl和Sorcin基因及其蛋白表達(dá)的影響。 方法： 采用MTT法測(cè)定海生素對(duì)K562及K562/ADM細(xì)胞的體外抑制作用，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白bcl-2、bax的表達(dá)，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞早期凋亡率、細(xì)胞周期和Pgp蛋白表達(dá)，

2、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)mdrl和Sorcin基因表達(dá)，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及Western blot檢測(cè)Sorcin蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 1、海生素在低濃度 0.1、1μg.ml<'-1>時(shí)對(duì)K562細(xì)胞無生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，細(xì)胞存活率分別為 96.23％、86.12％，而濃度為 10μg.ml<'-1>時(shí)細(xì)胞存活率為68.46％，細(xì)胞數(shù)明顯減少，在此濃度下隨時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞存活率有下降趨勢(shì)。較大

3、濃度100μg.ml<'-1>時(shí)細(xì)胞大部分死亡。 2、海生素在低濃度0.1、1、10μg.ml<'-1>時(shí)對(duì)K562/ADM細(xì)胞無生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，海生素在濃度為40μg.ml<'-1>時(shí)，可有明顯的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)生長(zhǎng)抑制越明顯，具有時(shí)效關(guān)系。 3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)海生素在濃度10μg.ml<'-1>時(shí)可阻止K562細(xì)胞周期于G<,1>/S期。 4、海生素在20ug.ml<'-1>濃度時(shí)，作用K5

4、62細(xì)胞12小時(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡率為(10.53±2.45)％與對(duì)照組(2.46±1.28)％比較p<0.05，在36小時(shí)早期細(xì)胞凋亡率為(35.45±3.21)％；隨濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞凋亡明顯，可出現(xiàn)細(xì)胞死亡。 5、海生素在濃度為40ug.ml<'-1>時(shí)作用K562/ADM 細(xì)胞可檢測(cè)到細(xì)胞凋亡亞G<,1>峰，海生素 (40μg.ml<'-1>)作用0、12、24、36、48、72小時(shí)，測(cè)定細(xì)胞早期凋亡率

5、，細(xì)胞凋亡率隨時(shí)間的延長(zhǎng)，在12、24小時(shí)凋亡率增加，而在36、48、72小時(shí)后細(xì)胞凋亡率增加不明顯。 6、海生素在濃度為 20μg.ml<'-1>和40μg.ml<'-1>時(shí)bcl-2 蛋白表達(dá)率為(58.78±4.65)％、(26.57±2.13)％。未經(jīng)海生素處理的K562細(xì)胞bcl-2呈強(qiáng)陽性表達(dá)(90.98±8.66)％。對(duì)照組K562細(xì)胞bax陰性表達(dá)，海生素(10μg.ml<'-1>)處理K562細(xì)胞后bax陽性

6、表達(dá)，海生素(20μg.ml<'-1>)處理K562細(xì)胞后bax強(qiáng)陽性表達(dá)。 7、對(duì)照組耐藥細(xì)胞 bcl-2 強(qiáng)陽性表達(dá)(0.09±0.01)；海生素(20μg.ml<'-1>)處理K562 耐藥細(xì)胞 24h、48h，檢測(cè)分析 bcl-2 陽性表達(dá)灰度值分別為 0.05±0.02、0.05±0.01，和對(duì)照組比較P<0.05，實(shí)驗(yàn)組bcl-2 陽性表達(dá)率與藥物濃度和作用時(shí)間有負(fù)相關(guān)性；對(duì)照組耐藥細(xì)胞bax陰性表達(dá)，海生素(20μ

7、g.ml<'-1>)處理K562耐藥細(xì)胞后bax弱陽性表達(dá)，海生素(40μg.ml<'-1>)處理K562耐藥細(xì)胞后bax強(qiáng)陽性，實(shí)驗(yàn)組bax陽性表達(dá)率與藥物濃度和作用時(shí)間有正相關(guān)性。海生素在一定濃度下對(duì)K562 及其耐藥細(xì)胞可上調(diào)bax蛋白表達(dá)而對(duì)bcl-2蛋白下調(diào)其表達(dá)。 8、通過PCR檢測(cè)不同濃度藥物對(duì)耐藥細(xì)胞mdrl表達(dá)無影響。 9、PCR 檢測(cè)也同樣發(fā)現(xiàn)不同濃度藥物對(duì)耐藥細(xì)胞Sorcin表達(dá)基因的無影響；應(yīng)用

8、Western blot檢測(cè)K562/ADM細(xì)胞Sorcin蛋白的表達(dá)。經(jīng)圖像分析K562/ADM細(xì)胞組Sorcin蛋白的表達(dá)與對(duì)照組無差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1、海生素可抑制K562和K562/ADM細(xì)胞生長(zhǎng)； 2、海生素可影響bcl-2 和bax蛋白表達(dá)使 K562細(xì)胞生長(zhǎng)周期停滯于G<,1>/S期； 3、海生素可通過下調(diào)bcl-2 蛋白表達(dá)、上調(diào)細(xì)胞bax蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡； 4