全人抗體高效真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表面重塑抗體rCAb1.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)以HAb18G/CD147-HAb18抗原抗體系統(tǒng)為基礎(chǔ)，構(gòu)建并篩選了用于全人抗體表達(dá)的高效真核載體；之后，克隆了抗人大腸癌抗體CAb1輕、重鏈可變區(qū)基因VH和VL，通過(guò)制備復(fù)性的嵌合cFab對(duì)獲得的基因的可靠性和準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證；進(jìn)而以獲得的CAb1的VH和VL為基礎(chǔ)，對(duì)其進(jìn)行人源化表面重塑抗體rCAb1設(shè)計(jì)；最終，選用鑒定的抗體真核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了重組rCAb1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。
　　第一部分研究?jī)?nèi)容：高效全人抗體真

2、核表達(dá)載體的構(gòu)建及篩選
　　目的：獲得具有自主產(chǎn)權(quán)，且能表達(dá)全人抗體的高效真核表達(dá)載體
　　方法：按照標(biāo)準(zhǔn)DNA重組操作，構(gòu)建以下不同的真核表達(dá)載體：包括弱化多順?lè)醋觩IRES1-18L;pIRES2-18H；定點(diǎn)重組載體18-pDHL-FRT；雙載體系統(tǒng)18H-pDHA，18L-pCI；反向雙載體系統(tǒng)18H-PCI，18L-p105；多順?lè)醋颖磉_(dá)載體18H-L-pCI-FRT；弱化篩選標(biāo)記載體18H-L-pCII；以及pA

3、H/pAG雙載體pAH4604-18，pAG4622-18，這些載體均含有單抗HAb18輕重鏈可變區(qū)基因和人IgG1κ的輕、重鏈恒定區(qū)基因。之后，將這些載體分別轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，斑點(diǎn)雜交檢測(cè)培養(yǎng)上清的情況，觀測(cè)是否有嵌合抗體cHAb18的表達(dá)；用夾心ELISA法檢測(cè)重組抗體的表達(dá)量。隨后，選用部分構(gòu)建載體，用電穿孔穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同表型的CHO細(xì)胞，有限稀釋進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，完成轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選；RT-PCR檢測(cè)穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系，觀察抗體基因

4、是否丟失，評(píng)估轉(zhuǎn)染載體的細(xì)胞穩(wěn)定性。進(jìn)行陽(yáng)性克隆的擴(kuò)大培養(yǎng)，表達(dá)產(chǎn)物的純化；SDS-PAGE凝膠電泳及其Westernblot檢測(cè)抗體的表達(dá)情況；選用細(xì)胞免疫熒光染色以及流式細(xì)胞檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的特異性。
　　結(jié)果：構(gòu)建了含有抗體基因的不同的真核載體，通過(guò)必要的PCR或酶切鑒定插入序列，均獲得了和理論上大小一致的片段，提示所有的載體均成功構(gòu)建。將其全部瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，斑點(diǎn)雜交結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞相比，除載體18H-L-pC

5、II與雙載體pAH/pAG沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)的IgG外，其余的載體均能檢測(cè)到抗體的表達(dá)；而用抗原HAb18G/CD147胞外區(qū)進(jìn)行的夾心ELISA結(jié)果證實(shí)：所有重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后均能成功檢測(cè)到嵌合抗體cHAb18的表達(dá)，所有的載體均在轉(zhuǎn)染48h后表達(dá)量達(dá)到較高水平，120h后表達(dá)量達(dá)到最高；其中雙載體pIRES1-18L/pIRES2-18H和pDHL-18FRT的量約達(dá)到1.4mg/L。進(jìn)一步選用三種不同的載體pIRES1-18L/pIR

6、ES2-18H，pDHL-18FRT和18H-L-pCII進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同表型的CHO細(xì)胞。夾心ELISA結(jié)果顯示上述不同的三種載體均較未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞有人IgG的表達(dá)，其中雙載體系統(tǒng)pIRES1-18L/pIRES2-18H的表達(dá)量約介于0.3-16mg/L;載體pDHL-18FRT的表達(dá)量可達(dá)到10mg/L；但是載體18H-L-pCII的抗體表達(dá)量，在進(jìn)行克隆化并加壓篩選的情況下卻沒(méi)有太多的變化，表達(dá)量均少于1.5mg/L。對(duì)pIRES

7、1-18L/pIRES2-18H轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞株1F6，穩(wěn)定傳代培養(yǎng)30代，RT-PCR仍能檢測(cè)到抗體基因的表達(dá)；進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，親合層析柱從約500ml的培養(yǎng)上清中純化，獲得約了7.5mg的表達(dá)產(chǎn)物，產(chǎn)物的純度較高。SDS-PAGE電泳和Westernblot檢測(cè)結(jié)果：目的蛋白分子量約為150kDa，還原后為兩條帶，分子量約為50kDa和25kDa，符合人IgG抗體的特征，且可以和羊抗人IgG結(jié)合。免疫熒光結(jié)果顯示表達(dá)純化的抗體可特異結(jié)

8、合表達(dá)有HAb18G/CD147的細(xì)胞。
　　結(jié)論：通過(guò)對(duì)載體的優(yōu)化設(shè)計(jì)和改造，獲得了能用于全人抗體表達(dá)的高效真核載體；其中以弱化多順?lè)醋觩IRES1-18L;pIRES2-18H以及定點(diǎn)重組載體18-pDHL-FRT表達(dá)量較高，均可進(jìn)一步用于其他抗體的表達(dá)。成功的篩選了抗HAb18G/CD147的嵌合IgG抗體cHAb18的穩(wěn)定細(xì)胞株，并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獲得高效表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物保持了良好的特異性和親合力。純化了重組表達(dá)的目標(biāo)全長(zhǎng)I

9、gG產(chǎn)物即人鼠嵌合抗體cHAb18，從而也進(jìn)一步驗(yàn)證了所獲得的表達(dá)載體是正確的且能用于表達(dá)全長(zhǎng)人IgG。
　　第二部分研究?jī)?nèi)容：抗人大腸癌單抗CAb1輕、重鏈基因克隆與鑒定
　　目的：獲得單抗CAb1的輕、重鏈可變區(qū)基因，及其嵌合Fd或嵌合輕鏈基因，制備相應(yīng)的小分子抗體cFab對(duì)所獲得的基因進(jìn)行鑒定。
　　方法：首先，從雜交瘤細(xì)胞CAb1提取總RNA，設(shè)計(jì)并選用合成引物，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增單抗CAb1Fd和輕鏈全長(zhǎng)基

10、因，連接人T載體后進(jìn)行序列測(cè)定和分析；然后用同源比較對(duì)單抗CAb1完整Fd的擴(kuò)增，獲得含有全長(zhǎng)的Fd和輕鏈基因的載體pMD18-T/Fd和pMD18-T/L；分別以pMD18-T/Fd和pMD18-T/L為模版，用對(duì)應(yīng)的引物B4、B4for和A8、A8for擴(kuò)增MAbCAb1重、輕鏈可變區(qū)基因VH和VL，分別插入含有人CH1和CL的表達(dá)載體pComb3C后獲得載體pComb3C/cFab；以載體pComb3C/cFab為模板，再次采用相

11、應(yīng)的引物擴(kuò)增嵌合Fd或嵌合輕鏈基因，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶分別消化質(zhì)粒pET32a（+）及純化的PCR產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)連接轉(zhuǎn)化鑒定獲得載體pET-CAbH和pET-CAbL。誘導(dǎo)表達(dá)含有重組表達(dá)質(zhì)粒的菌株，分別表達(dá)嵌合cFd和cL并進(jìn)行純化。將其分別溶解后，按絕對(duì)量等摩爾量比混合，用梯度透析的方法進(jìn)行復(fù)性。SDS-PAGE和Westernblot對(duì)嵌合Fab進(jìn)行檢測(cè)，觀察產(chǎn)物的復(fù)性情況；用ProteinG的柱子純化產(chǎn)物后，選用間接ELISA，免

12、疫熒光染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)復(fù)性產(chǎn)物的靶抗原結(jié)合活性，最后采用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)該小分子抗體和鼠源單抗CAb1是否競(jìng)爭(zhēng)同一個(gè)抗原表位。
　　結(jié)果：從1×107的雜交瘤細(xì)胞CAb-1細(xì)胞中獲得總RNA量約62.5μg。甲醛變性電泳顯示總RNA比較完整，能夠準(zhǔn)確清晰的觀察到5S，18S和28S的銳利條帶。獲得mAbCAb1基因序列，VH基因長(zhǎng)351bp，編碼117個(gè)氨基酸；VL基因長(zhǎng)336bp，編碼112個(gè)氨基酸；CAb-1CH1屬于

13、IgG1，CL屬于κ型。優(yōu)化其mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能，構(gòu)建了非融合表達(dá)載體pET-CAbH，pET-CAbL，成功實(shí)現(xiàn)了抗體的嵌合Fd或嵌合輕鏈在大腸桿菌中的高效表達(dá)，蛋白表達(dá)量在30°C誘導(dǎo)6h后分別達(dá)到菌體總蛋白的23.6％和29.2％。通過(guò)體外復(fù)性，SDS-PAGE結(jié)果顯示在起始總蛋白濃度100μg/ml時(shí)，復(fù)性的cFab的回收率高達(dá)70.2％。免疫熒光和FACS的結(jié)果顯示復(fù)性的cFab能夠比較特異的結(jié)合到大腸癌細(xì)胞系SW480

14、和Hce-8693，但是卻不和正常的細(xì)胞結(jié)合。競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)顯示復(fù)性的cFab和親本CAb-1抗體片段F(ab')2互相競(jìng)爭(zhēng)相同表位。
　　結(jié)論：獲得了雜交瘤細(xì)胞CAb1的輕重鏈可變區(qū)基因，所設(shè)計(jì)的引物對(duì)鼠IgG1類抗體基因的擴(kuò)增是有效的。表達(dá)并制備了嵌合cFd和cL，優(yōu)化mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能對(duì)蛋白的非融合表達(dá)具有重要作用。實(shí)現(xiàn)體外復(fù)性制備小分子cFab，該分子能特異的結(jié)合大腸癌細(xì)胞，所獲得的分子具有結(jié)合活性；復(fù)性的cFa

15、b能和親本的CAb-1相互競(jìng)爭(zhēng)，提示它們識(shí)別的抗原表位一致；由于制備的cFab抗原有結(jié)合活性，進(jìn)一步提示所獲得雜交瘤細(xì)胞CAb1基因是正確和可靠的，同時(shí)也印證了該方案對(duì)鑒定所克隆的CAb1可變區(qū)基因的有效性。
　　第三部分研究?jī)?nèi)容：抗人大腸癌表面重塑抗體rCAb1表達(dá)和純化
　　目的：用構(gòu)建的真核表達(dá)載體制備抗人大腸癌表面重塑抗體rCAb1，對(duì)表達(dá)的抗體進(jìn)行初步純化和鑒定
　　方法：首先通過(guò)對(duì)大腸癌單抗CAb1的抗體可

16、變區(qū)序列分析，并同Genbank的nr庫(kù)做BlastP，從中抽取所有抗體可變區(qū)氨基酸序列信息構(gòu)建本地抗體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)。進(jìn)而將抗體種屬來(lái)源結(jié)合輕、重鏈類型將抗體序列分為四類，其中抗體序列來(lái)源分別選擇Homosapiens和Musmusculus兩類。對(duì)相似性得分最高的人源、鼠源抗體可變區(qū)序列各200條進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，獲得單抗CAb1的差異殘基和異常殘基；之后通過(guò)模建抗體可變區(qū)的精確三維模型，獲得CAb1的VH、VL分子內(nèi)和分子間氫鍵相互作用，最終

17、確定進(jìn)行人源化改造的候選突變位點(diǎn)；依據(jù)確定的候選位點(diǎn)，對(duì)突變后的抗體人源化可變區(qū)序列用重疊PCR的方法合成，分別與T載體（pMD18-T）連接構(gòu)建成克隆載體pMD18-T/VH和pMD18-T/VL進(jìn)行序列測(cè)定。利用上述的可變區(qū)序列，分別構(gòu)建輕鏈表達(dá)載體pIRES1-CAbL和重鏈表達(dá)載體的pIRES2-CAbH（弱化多順?lè)醋酉到y(tǒng)），用PCR和相應(yīng)的酶切鑒定。將獲得的雙載體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，夾心ELISA法檢測(cè)抗體的表達(dá)情

18、況。最后，將這兩個(gè)載體共轉(zhuǎn)CHO-dhfr-細(xì)胞，夾心ELISA法檢測(cè)產(chǎn)物的表達(dá)情況；用有限稀釋法進(jìn)行陽(yáng)性克隆的篩選，擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行抗體表達(dá)產(chǎn)物的純化，純化樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析和Westernblot檢測(cè)。細(xì)胞免疫熒光染色以及流式細(xì)胞檢測(cè)觀察純化產(chǎn)物對(duì)大腸癌細(xì)胞的結(jié)合活性。最后選用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA檢測(cè)該rCAb1是否與親本鼠CAb1競(jìng)爭(zhēng)同一表位，同時(shí)根據(jù)50％抑制率時(shí)的人源抗體與親本鼠抗體濃度的比值，估計(jì)該人源化IgG的

19、相對(duì)親和力。
　　結(jié)果：按照Kabat、Abm、Chothia和Contact的規(guī)則標(biāo)出了大腸癌單抗CAb1的不同的CDR，SDR區(qū)；經(jīng)過(guò)篩選的抗體序列經(jīng)過(guò)分析，獲得了已有抗體分子不同位點(diǎn)上氨基酸種類和百分比，將該結(jié)果和單抗CAb1的可變區(qū)氨基酸比對(duì)后，獲得了該序列的差異殘基和異常殘基；結(jié)合三維重建模型，獲得了CAb1VH、VL分子內(nèi)和分子間氫鍵相互作用和氨基酸表面可及性，并最終確定了初步進(jìn)行人源化改造的候選突變位點(diǎn)即重鏈的T01

20、8S，N086S和輕鏈的Q018P。重疊PCR合成突變的基因后，分別與T載體連接，獲得了克隆載體pMD18-T/VH和pMD18-T/VL，測(cè)序結(jié)果顯示可變區(qū)基因成功合成。構(gòu)建的輕鏈表達(dá)載體pIRES1-CAbL和重鏈表達(dá)載體的pIRES2-CAbH經(jīng)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后，夾心ELISA證明存在人IgG的表達(dá)；將這兩個(gè)載體共轉(zhuǎn)CHO-dhfr-細(xì)胞，經(jīng)過(guò)克隆篩選，表達(dá)產(chǎn)物的純化，SDS-PAGE電泳和Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明：