惡性瘧原蟲動合子期表面抗原單鏈抗體基因的改造、原核表達及其轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建.pdf

1、研究背景：蚊蟲可傳播許多嚴重的人類疾病，其中，瘧疾更是目前世界上最普遍也是最致命的疾病之一，每年全球約有5億人被瘧疾感染，估計死亡人數(shù)有270萬，是WHO公布的“十大重點防治的疾病”之一，2005年我國報告瘧疾發(fā)病42319例，發(fā)病率為0.59/萬。由于對瘧疾缺乏有效的疫苗，一直以來對瘧疾的預防主要是通過蚊媒的控制來阻斷其傳播。DTT、溴氰菊酯等化學殺蟲劑的研制成功曾經(jīng)給蚊媒病的防治帶來一線曙光，但隨著蚊蟲抗藥性的產(chǎn)生，這個幻想又破滅了

2、。而瘧原蟲耐藥性的出現(xiàn)意味著控制蚊媒再一次成為最有效且實用的減輕瘧疾負擔的方法，但研制新化學藥物所需費用昂貴及使用殺蟲劑對環(huán)境造成污染等方面的問題，迫使人們?nèi)ふ倚碌耐緩絹砜刂莆妹健，F(xiàn)代分子生物學和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅猛發(fā)展給瘧疾的防治帶來了新的方法：這種方法主要是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將一些效應分子基因插入到蚊蟲的基因組中，然后在特異啟動子驅(qū)動下大量高效表達，從而起到影響瘧原蟲生長發(fā)育甚至將其殺死的作用。 瘧原蟲抗性轉(zhuǎn)基因蚊的研究經(jīng)歷了二十

3、幾年的發(fā)展，如今已經(jīng)形成了一套比較成熟的技術(shù)手段，如有效的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染體系、合適的報告基因、有效的組織與時期特異性啟動子和有效的基因?qū)敕椒ǖ?。在這些技術(shù)支持的基礎(chǔ)上，需要選擇合適的效應分子，使之在基因修飾蚊蟲體內(nèi)有效表達并發(fā)揮抗瘧作用。根據(jù)瘧原蟲的生活史，動合子期是瘧原蟲在蚊體內(nèi)發(fā)育的最薄弱環(huán)節(jié)，因此，選擇這個時期作為靶標對其進行攻擊具有明顯的優(yōu)勢。Pfs25是惡性瘧原蟲動合子期表達的一種最主要的表面抗原，研究顯示，抗Pfs25的單鏈抗

4、體487能明顯阻斷蚊體內(nèi)瘧原蟲動合子發(fā)育成卵囊。本課題組欲嘗試以單鏈抗體487作為效應分子構(gòu)建瘧原蟲抗性轉(zhuǎn)基因蚊，然而先前的實驗發(fā)現(xiàn)，487在轉(zhuǎn)基因蚊體內(nèi)的表達效果并不理想。因此我們嘗試對487的編碼基因進行改造，在不改變其編碼的氨基酸序列基礎(chǔ)上，根據(jù)宿主(按蚊)的密碼子偏嗜情況對487基因的堿基序列進行修改，并將修改后的487基因(m487)與按蚊本身的免疫效應分子CecropinA基因連接，構(gòu)建融合基因Cep&m487；然后將Cep

5、&m487基因序列克隆入pET32a(+)載體中進行原核表達，初步鑒定其體外生物活性；并把Cep&m487基因連接入帶有眼特異性啟動子(3x3p)驅(qū)動的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標志物、岡比亞按蚊羧肽酶(Anophelesgambiaecarboxypeptidase，AgCP)啟動子及piggyBac轉(zhuǎn)座元件的重組轉(zhuǎn)化載體，用顯微注射的方法將其注入新鮮蚊卵中用以觀察其轉(zhuǎn)化效果。 目的： 1.改造抗惡性瘧原蟲Pf

6、s25單鏈抗體487的編碼基因； 2.原核表達改造后的融合基因Cep&m487，并對表達的重組蛋白進行初步的體外生物學活性鑒定； 3.構(gòu)建由眼異性性啟動子(3x3p)驅(qū)動的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標志物、AgCP啟動子驅(qū)動的抗瘧原蟲動合子抗體基因及具有高度特異性轉(zhuǎn)座元件piggyBac組成的重組轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒pBac-AgCP-Cep&m487； 4.用顯微注射的方法將重組載體質(zhì)粒pBac-AgCP-Ce

7、p&m487注入新鮮蚊卵中并觀察其轉(zhuǎn)化效果。 方法： 1.比較岡比亞按蚊和小鼠的密碼子使用頻率，將鼠源性487基因中按蚊的稀有密碼子替換成按蚊偏好的密碼子； 2.將按蚊本身的免疫效應分子CecropinA基因與修改后的487連接，構(gòu)建并合成融合基因Cep&m487。 3.設(shè)計引物擴增Cep&m487，利用酶切、連接反應構(gòu)建pET32a(+)-Cep&m487重組質(zhì)粒，并進行PCR酶切鑒定和測序分析；

8、 4.將重組質(zhì)粒pET32a(+)-Cep&m487轉(zhuǎn)入BL21(DE3)中，IPTG誘導表達并對表達的重組蛋白進行純化； 5.WesternBlot分析重組蛋白的免疫反應性； 6.瓊脂糖擴散法初步檢測重組蛋白的體外抑菌活性。 7.設(shè)計酶切位點，通過酶切，連接等方法，將融合基因Cep&m487經(jīng)穿梭質(zhì)粒pSlfal180fa連接到AgCP啟動子下游，然后將AgCP-Cep&m487克隆入轉(zhuǎn)移載體pBac[3x3

9、p-DsRedafm]，構(gòu)建重組轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒pBac-AgCP-Cep&m487。 8.運用顯微注射技術(shù)將重組轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒pBac-AgCP-Cep&m487注入新鮮的蚊卵； 9.對孵化出的幼蟲進行轉(zhuǎn)化效果的初步分析。 結(jié)果： 1.成功對鼠源性抗惡性瘧原蟲Pfs25單鏈抗體487的編碼基因進行了改造。 2.成功構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET32(+)-Cep&m487，通過IPTG誘導后，重組蛋白主要以包

10、涵體形式高效表達，WesternBlot結(jié)果顯示重組蛋白與抗6-his-tag抗體具有特異的免疫反應性；瓊脂糖擴散法顯示重組蛋白無體外抑菌活性。 3.構(gòu)建出由眼異性性啟動子(3x3p)驅(qū)動的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標志物、AgCP啟動子驅(qū)動的抗瘧原蟲動合子抗體基因及具有高度特異性轉(zhuǎn)座元件piggyBac組成的重組轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒pBac-AgCP-Cep&m487。 4.微注射了1000只蚊卵，孵化率達5％，熒光顯

11、微鏡下沒有觀察到表面篩選標記陽性(紅色眼)的個體。 結(jié)論： 1.構(gòu)建了融合的抗惡性瘧原蟲動合子抗體基因Cep&m487； 2.該基因在E.coli中高效表達，表達的重組蛋白與抗6-his-tag抗體具有特異的免疫反應性，重組蛋白純化后不顯示體外抑菌活性； 3.構(gòu)建出由眼特異性啟動子(3x3p)驅(qū)動的紅色熒光蛋白(DsRed)作為篩選標志物、AgCP啟動子驅(qū)動的抗瘧原蟲動合子抗體基因及具有高度特異性轉(zhuǎn)座元件