鬼臼毒素衍生物ZM-10對口腔鱗狀細胞癌KB細胞株的作用及其機制研究.pdf

1、目的：鬼臼毒素(podophyllotoxin)是由中草藥中分離提取的具有抗腫瘤活性的有效成分，對腫瘤細胞具有抑制作用。但其水溶性差、抗瘤譜窄和較為嚴重的骨髓抑制作用限制了其廣泛應用，而經(jīng)過了一系列改造過程形成的鬼臼毒素新衍生物ZM-10可減少其毒副作用。本實驗通過研究ZM-10作用下KB細胞的形態(tài)學改變、生長狀況等指標，探討其對于口腔鱗狀細胞癌的應用前景。 材料和方法： 1.實驗材料：口腔鱗狀細胞癌KB細胞株2 實驗方

2、法；口腔鱗狀細胞細胞癌KB細胞接種于含10％胎牛血清，100單位/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)瓶置于37℃、5％C02飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每1～2天換培養(yǎng)液一次。當細胞生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面時，用0.25％胰蛋白酶消化，傳代。MTT法檢測ZM-10的抗癌活性，確定其對KB細胞的半數(shù)生長抑制濃度后進行促凋亡機制的研究，各實驗均分為四組：A組(0.1％DMSO處理24小時)，B組(1.5gr

3、aol/L ZMm-10處理24小時)，C組(3μmol/L ZM-10處理24小時)，D組(6gmol/LZM-10處理24小時)，應用倒置光顯微鏡、熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變；應用瓊脂糖凝膠電泳分析ZM-10對KB細胞染色體DNA斷裂的影響；應用流式細胞術(shù)分析ZM-10對KB細胞周期的影響和誘導凋亡率的變化；應用RT-PCR法檢測各組細胞P53、Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達的變化。結(jié)果： 1.MT

4、T法發(fā)現(xiàn)ZM-10對口腔鱗狀細胞癌KB細胞株的半數(shù)抑制濃度(IC50)為3μmol/L。通過觀察對KB細胞生長曲線的影響，發(fā)現(xiàn)在不同濃度的ZM-10作用下，能顯著抑制KB細胞的增殖，并具有量效關(guān)系。 2.流式細胞儀檢測B、C、D三個實驗組均有特征性的凋亡峰形成。對照組A組凋亡率為15.5±1.53％，實驗組B組凋亡率為18.6±3.8％，C組凋亡率為25.6±2.87％，D組凋亡率為37.2±4.5％，加藥各組(B、C、D組)的

5、凋亡率與對照組A組相比有顯著性差異(p＜0.05)。且結(jié)果顯示與空白對照組相比ZM-10可在抑制細胞各時相的同時，使細胞周期阻斷在G2+M期。 3.ZM-10處理KB細胞后細胞形態(tài)的改變.熒光顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)KB細胞凋亡的形態(tài)學變化，細胞核染色質(zhì)發(fā)生聚集、碎裂，細胞核固縮呈均一的致密物，進而斷裂，細胞膜不斷出芽、脫落，細胞變成數(shù)個大小不等的凋亡小體，并且隨著ZM-10濃度的加大，鏡下這種細胞形態(tài)的變化愈來愈明顯，表明凋亡細胞的

6、比例逐漸增加，具有劑量依賴性。 4 在經(jīng)典的DNA降解斷裂檢測實驗中，抽提B、C、D組富集小分子量DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，呈現(xiàn)典型的“DNA梯子”(DNA ladder)與A組形成明顯對照，表明ZM-10誘導KB細胞發(fā)生凋亡。 5 通過流式細胞儀對細胞的DNA含量進行測定，可見B、C、D組于正常G0/G1細胞群前出現(xiàn)DNA低染細胞群，稱為“A0細胞群”或“亞G1細胞群，Sub-G1”即凋亡細胞群，該現(xiàn)象被認為是細胞發(fā)生

7、凋亡的標志之一，且凋亡細胞的比例隨著ZM-10濃度的升高而增大，呈一定的劑量依賴性。綜上結(jié)果可以認為ZM-10能夠誘導腫瘤細胞的凋亡。 6 ZM-10對KB細胞凋亡相關(guān)基因P53、Caspase-3、Bcl-2和Bax的mRNA表達的影響。RT-PCR結(jié)果顯示B、C、D細胞中P53，Caspase-3和Bax的mRNA的表達升高，同時降低了Bcl-2的mRNA的表達，同對照組A組相比均有顯著性差異。提示ZM-10誘導腫瘤細胞凋亡的作用是

8、依靠上調(diào)了Caspase-3，p53和Bax mRNA的表達，同時協(xié)同下調(diào)抑制凋亡基因Bcl-2的表達，從而誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。 結(jié)論： (1)ZM-10可誘導KB細胞發(fā)生凋亡。(2)不同同濃度ZM-10作用于KB細胞，使細胞周期發(fā)生改變，并且可將腫瘤細胞阻斷在G2+M期。(3)不同同濃度ZM-10作用于KB細胞，影響腫瘤細胞內(nèi)相關(guān)癌基因及抑癌基因P53、Caspase-3、Bcl-2和Bax mRNA的表達。(4)ZM-10