鬼臼毒素衍生物8b逆轉K562-A02細胞多藥耐藥及其機制研究.pdf

1、目的:研究鬼臼毒素衍生物8b體外逆轉K562/A02細胞多藥耐藥作用，并初步探討其作用機制。
　　方法:
　　1、多藥耐藥細胞K562/A02耐藥性的檢測及相關蛋白的表達。(1)MTT法鑒定K562/A02細胞多藥耐藥性;(2) RT-PCR法鑒定K562與K562/A02細胞mdr-1基因的表達差異;(3) Western blot法鑒定K562與K562/A02細胞P-gp蛋白的表達差異。
　　2、鬼臼毒素衍生物8

2、b對K562/A02細胞抗腫瘤治療敏感性的影響。(1)MTT法檢測系列鬼臼毒素衍生物及8b對K562/A02抗腫瘤治療敏感性的影響;(2)流式細胞儀檢測8b對K562/A02抗腫瘤治療敏感性的影響。
　　3、鬼臼毒素衍生物8b毒性評價。(1) MTT法測定8b對正常細胞的影響;(2)8b與維拉帕米對小鼠毒性的初步比較。
　　4、鬼臼毒素衍生物8b對P-糖蛋白功能與表達的影響。(1)流式細胞儀檢測8b對細胞Rho-123蓄積的

3、影響;(2) Pgp-GloTM檢測試劑盒檢測8b對P-gp ATP酶活性的影響;(3) RT-PCR法測定8b對mdr-1、BCRP、LRP及MRP等耐藥相關基因表達的影響;(4) Western blot法測定8b對P-gp蛋白表達的影響。
　　5、鬼臼毒素衍生物8b影響P-gp表達相關的分子機制。(1) RT-PCR法測定8b對mdr-1相關基因PTEN、PI3K、Akt1及NF-κB表達的影響;(2) Western bl

4、ot法測定8b對P-gp相關蛋白β-tubulin、Akt1、ERK1/2及其磷酸化蛋白p-ERK1/2等的影響。
　　結果:
　　1、多藥耐藥細胞K562/A02耐藥性的檢測及相關蛋白的表達的檢測
　　1.1通過MTT法測定了ADM、VP-16及PTX對體外培養(yǎng)的K562及K562/A02細胞活性的影響，ADM、VP-16及PTX對非耐藥細胞K562抑制作用較高，對耐藥細胞K562/A02抑制作用較低，耐藥比RF值分

5、別為30.619、23.334、92.188，說明此耐藥細胞對多種作用機制不同的化療藥物具有明顯的耐藥性。
　　1.2耐藥細胞K562/A02中mdr-1基因表達量明顯較高，非耐藥細胞K562中mdr-1基因幾乎未表達，具有明顯差異。
　　1.3 Western blot法測定K562與K562/A02細胞P-gp蛋白的表達差異，耐藥細胞K562/A02中P-gp蛋白表達量明顯較高，非耐藥細胞K562中P-gp蛋白幾乎未表達

6、，其具有明顯差異。
　　2、鬼臼毒素衍生物8b對K562/A02細胞抗腫瘤治療敏感性的影響
　　2.1通過MTT法篩選了23種本課題組新合成的鬼臼毒素衍生物，發(fā)現(xiàn)其中MHC-3、8b及11b這三種新型化合物自身毒性較低且具有良好的逆轉K562/A02細胞耐藥性的能力，于是本課題組選定潛力較大的化合物8b，測定了8b對K562/A02及MCF-7A細胞抗腫瘤治療敏感性的影響，8b能夠劑量依賴性的逆轉K562/A02細胞對ADM

7、的耐藥作用，效果明顯優(yōu)于陽性對照藥VRP，對MCF-7A細胞逆轉效果略強于VRP，并且8b在給藥劑量下對非耐藥細胞K562、MCF-7無顯著影響。
　　2.2流式細胞儀檢測8b對K562/A02抗腫瘤治療敏感性的影響發(fā)現(xiàn)，只加入阿霉素的K562/A02細胞存活率較高，為89.0％，當同時加入8b(0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L)后，存活率下降為69.3％、55.7％、44.2％，具有濃度依賴性，且陽性對

8、照藥物維拉帕米組（1.0μmol/L）的存活率為65.3％。說明等濃度下8b逆轉K562/A02耐阿霉素的能力優(yōu)于維拉帕米。
　　3、鬼臼毒素衍生物8b毒性評價
　　3.1 MTT法測定8b對正常細胞的影響，發(fā)現(xiàn)8b對人心肌細胞H9C2、人永生化角質形成細胞HaCaT及人血管內皮細胞VEC在較低劑量下(10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L、0.01μmol/L)均無影響，說明8b在給藥劑量下對正常細胞生長無抑

9、制作用。
　　3.28b與維拉帕米對小鼠毒性初步比較，發(fā)現(xiàn)給予維拉帕米LD50(8 mg/kg)的小鼠死亡率達60.0％，等濃度及高濃度的8b(8 mg/kg、40 mg/kg)則對小鼠生存無影響。
　　4、鬼臼毒素衍生物8b對P-gp功能與表達的影響
　　4.1流式細胞儀檢測8b對細胞Rho-123蓄積的影響，加入Rho-123后，K562細胞峰位置偏右，K562/A02細胞峰位置偏左，同時加入8b或陽性藥物VRP后

10、，峰位置明顯右移。與K562/A02對照組相比，8b（0.5μmol/L、1.0μmol/L、2.0μmol/L）及VRP（10.0μmol/L）可明顯增加平均光密度值，具有顯著性差異。尤其是8b劑量為VRP組濃度的1/20時，就能產(chǎn)生等效的Rho-123外排效應。
　　4.2 Pgp-GloTM Assay Systems檢測不同濃度8b對P-gp ATP酶消耗作用的影響。ΔRLUTC代表受試藥物8b對ATP酶活性的影響，結果顯

11、示ΔRLUTC＞ΔRLUbasal，且具有濃度依賴性，表明受試藥物為P-gp的ATP酶活性激動劑。
　　4.3 RT-PCR法測定8b對mdr-1、BCRP、MRP及LRP等耐藥相關基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)在加入8b后mdr-1基因下降，而BCRP、MRP及LRP等基因未發(fā)生明顯變化。
　　4.4 Western blot法測定8b對P-gp蛋白表達的影響，在加入8b后P-gp蛋白表達下降，與對照組相比具有顯著性差異。
　

12、　5、鬼臼毒素衍生物8b影響P-糖蛋白表達的分子機制
　　5.1 RT-PCR法測定鬼臼毒素衍生物8b對mdr-1相關基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)在加入8b后PTEN基因未發(fā)生變化，而PI3K、Akt1及NF-κB等基因出現(xiàn)不同程度的下降。
　　5.2 Western blot法測定鬼臼毒素衍生物8b對P-gp相關蛋白的影響，在加入8b后β-tubulin、ERK1/2及其磷酸化蛋白p-ERK1/2表達未發(fā)生明顯改變，Akt1蛋白表

13、達下降，與對照組相比具有顯著性差異。
　　結論:鬼臼毒素衍生物8b能在體外逆轉K562/A02細胞的多藥耐藥性，且逆轉劑量下對正常細胞無毒，與陽性藥物維拉帕米相比8b在體外顯示了更強的逆轉效率。8b逆轉多藥耐藥作用機制可能與以下途徑有關:1激活P糖蛋白ATP酶活性，消耗ATP酶從而減弱P糖蛋白的轉運功能;2通過下調PI3K、Akt1及NF-κB等基因的表達抑制mdr-1基因，進而下調mdr-1翻譯產(chǎn)物P-gp蛋白的表達;3直接下調