新型鬼臼毒素衍生物LGN抗人肺腺癌細胞A549作用及其機制的研究.pdf

1、目的:
　　 本文研究新型鬼臼毒素衍生物LGN抑制人肺腺癌細胞株A549作用，并初步探討其作用機制。
　　 方法:
　　 1、利用體外抗腫瘤篩選的方法MTT法和SRB法檢測LGN的體外抗腫瘤活性。MTT法測定LGN和陽性對照藥依托泊苷(VP-16)體外對各腫瘤細胞（A549、SKVO3、LOVO、Hela、HepG-2、K562）及正常細胞(VEC、MC-3T3)的IC50值或GI50值。
　　 2、利用

2、Giemsa染色法在光學顯微鏡下觀察LGN作用后A549細胞株細胞形態(tài)學的變化和利用Hoechst染色法在熒光顯微鏡下觀察LGN作用后A549細胞株細胞核形態(tài)的變化。
　　 3、利用DNAladder法分析LGN作用A549細胞后，細胞染色體是否出現(xiàn)規(guī)律的斷裂情況（細胞凋亡特征）。
　　 4、利用流式細胞術定量分析不同濃度LGN對A549細胞周期及其凋亡率的影響。
　　 5、利用RT-PCR檢測LGN在不同濃度（

3、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L）對A549細胞p53、bcl-2、bax、p21、topoⅡα、PCNA、caspase-3mRNA表達的影響。
　　 6、利用Western-blot檢測LGN在不同濃度（0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L）對A549細胞PCNA蛋白的表達。
　　 結果:
　　 1、LGN體外抑制多種腫瘤細胞增殖
　　 利用常用的簡便體外抗腫瘤

4、篩選法:MTT和SRB法檢測了LGN的體外抑制腫瘤增殖的作用，結果表明LGN對多種腫瘤細胞均有較好的抑制作用，IC50值為0.22～0.77μmol/L;對A549抑制作用尤其顯著IC50值為0.22±0.11μmol/L，比陽性對照藥依托泊苷（VP-16IC50值為4.99±0.45μmol/L）在體外顯示了更強的抑制腫瘤增殖的效果大約高22倍。實驗顯示LGN對人的正常血管內皮細胞(VEC)和成骨細胞(MC-3T3)具有較低的毒性IC

5、50值分別為28.41±1.49，21.63±1.11μmol/L，提示其對腫瘤細胞有較好的選擇性。進一步通過SRB法測得LGN對多種腫瘤細胞的GI50為0.43～1.72μmol/L，與MTT結果一致。接著又通過生長曲線法觀察不同濃度LGN對A549細胞作用7天后對其生長狀態(tài)產(chǎn)生的影響，結果顯示3μmol/LLGN在第二天就可以完全抑制腫瘤細胞的增殖，并呈劑量依賴性，同等濃度LGN對腫瘤細胞生長抑制效應強于陽性對照的VP-16。

6、>　　 2、LGN誘導腫瘤細胞凋亡
　　 2.1、形態(tài)學觀察:Giemsa染色和Hoechst33342熒光染色結果均顯示LGN作用于A549細胞后，細胞出現(xiàn)染色體固縮、凝集，凋亡小體的產(chǎn)生，核膜的皺縮等凋亡的特征性改變。
　　 2.2、生化學觀察:DNA瓊脂糖凝膠電泳顯示LGN作用于A549細胞后出現(xiàn)典型“DNALadder”梯子圖。
　　 2.3、流式細胞儀檢測:流式細胞儀檢測顯示A549凋亡細胞的比例與L

7、GN濃度間具有良好的量效關系。
　　 以上結果均可以說明LGN能夠誘導A549細胞發(fā)生凋亡。
　　 3、LGN對A549細胞周期的影響
　　 流式細胞儀檢測細胞周期分布顯示LGN對A549各生長時相都有抑制效應，G1期細胞的比例下降，S期細胞的比例先略升高后降低，G2+M期細胞的比例增加明顯，且呈明顯的劑量依賴性，表明LGN可以將細胞阻滯在G2+M期。
　　 4、LGN對A549凋亡相關基因mRNA和to

8、poⅡα基因mRNA的測定
　　 RT-PCR結果顯示不同濃度的LGN（0.5、4、8μmol/L）作用于A549細胞24h后，成劑量依賴性地上調了p21、bax、p53、caspase-3、topoⅡα的mRNA表達，同時降低bcl-2和PCNAmRNA的表達，同溶劑對照組相比有顯著性的差異（P＜0.05）。
　　 5、LGN對A549PCNA蛋白表達的測定
　　 Western-blot結果顯示不同濃度的LG