鬼臼毒素衍生物P100抗腫瘤多藥耐藥作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：本文以多種腫瘤細(xì)胞和小鼠 H22肝癌移植瘤為實(shí)驗(yàn)對象，研究鬼臼毒素衍生物 P100的抗腫瘤作用，同時(shí)以 K562細(xì)胞及多藥耐藥K562/A02細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象研究腫瘤多藥耐藥機(jī)制以及 P100抗多藥耐藥的機(jī)制。
　　方法：
　　1.通過MTT法檢測K562/A02細(xì)胞的多藥耐藥性及P100對多種腫瘤細(xì)胞的抑制效果。
　　2.建立小鼠H22肝癌移植瘤模型，通過尾靜脈一次注射P100(5,10,20 mg/kg’wei

2、ght)藥液評價(jià)體內(nèi)抗腫瘤作用。
　　3.通過Hoechst33342、PI染色法觀察P100誘導(dǎo)K562細(xì)胞及K562/A02細(xì)胞的凋亡形態(tài)；DAPI染色法觀察P100誘導(dǎo)K562/A02細(xì)胞的凋亡形態(tài)。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測P100誘導(dǎo)K562細(xì)胞及K562/A02細(xì)胞凋亡的凋亡率
　　5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測K562細(xì)胞及P100作用K562/A02細(xì)胞后PI3K基因、Akt基因、NF-κB基因、MDR-1

3、基因、MRP基因、Caspase3基因、Caspase9基因mRNA表達(dá)的影響
　　6.Western Blot法檢測K562細(xì)胞及P100作用K562/A02細(xì)胞后PI3K p110α蛋白、Akt1蛋白、Phospho-Akt1蛋白、IκBα蛋白、Phospho-IκBα蛋白、NF-κB p65蛋白、Phospho-NF-κB p65蛋白、P糖蛋白、Caspase3蛋白、Cleaved Caspase3蛋白、Caspase9蛋白

4、、Cleaved Caspase9蛋白、Caspase8蛋白及Cleaved Caspase8蛋白表達(dá)的影響
　　7.通過RNAi技術(shù)干擾K562A/02細(xì)胞中MDR-1基因、NF-κB P65基因、Akt1基因的表達(dá)，檢測K562A/02細(xì)胞對阿霉素的耐藥性及相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　1.MTT法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)K562A/02細(xì)胞對多種作用機(jī)制不同的抗腫瘤藥物均有明顯耐藥性；P100對H4細(xì)胞、Hela細(xì)胞

5、、A549細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞、K562細(xì)胞、K562/A02細(xì)胞均有較好的抑制活性(IC50值范圍：0.06μmol/L~9.6μmol/L)，而且抑制活性普遍高于陽性藥物 VP-16，尤其對多藥耐藥細(xì)胞 K562/A02，陽性對照藥 VP-16的抑制效果較差(IC50值：21.83±4.78μmol/L)，而 P100能有效抑制 K562A/02細(xì)胞生長(IC50值：4.90±0.86μmol/L)。另外，P100對人正常血管內(nèi)皮細(xì)

6、胞926、心肌細(xì)胞H9C2均無明顯毒性。
　　2.小鼠 H22移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：不同濃度的P100(5,10,20 mg/kg’weight)對小鼠肝癌移植瘤生長有明顯的抑制，抑制率分別達(dá)到31.3％、50.6%、70.0%。陽性對照藥 VP-16(20 mg/kg’weight)抑制率為51.3%。
　　3.Hoechst33342、PI染色結(jié)果顯示K562細(xì)胞及K562A/02細(xì)胞形態(tài)完整，隨著不同濃度P100作用，細(xì)

7、胞開始出現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)，細(xì)胞發(fā)生皺縮、碎裂，有凋亡小體產(chǎn)生。隨藥物濃度增加凋亡越明顯；DAPI染色結(jié)果顯示隨著不同濃度P100作用，K562/A02細(xì)胞開始皺縮，部分細(xì)胞胞核固縮。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示不同濃度的P100(1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L)誘導(dǎo) K562細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡比例分別為23.92±2.15%、54.37±4.97%、65.09±5.63%， VP-16(4μmol/L)組的凋亡比例

8、為43.46±2.30%。P100(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)誘導(dǎo)K562/A02細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡比例分別為16.06±1.23%、27.29±3.36%、55.56±2.69%，陽性對照藥VP-16(10μmol/L)組的凋亡比例為21.08±3.76%?？梢奝100誘導(dǎo)K562及K562/A02細(xì)胞凋亡能的力明顯強(qiáng)于VP-16。
　　5.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示K562A/02細(xì)胞比K562細(xì)胞

9、中PI3K基因、Akt1基因、NF-κB基因、MDR-1基因、MRP基因mRNA表達(dá)升高，不同濃度 P100(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)作用后可下調(diào)K562A/02細(xì)胞PI3K基因、Akt基因、NF-κB基因、MDR-1基因、MRP基因mRNA表達(dá)，并上調(diào)Caspase9基因、Caspase3基因mRNA表達(dá)。
　　6.Western Blot檢測結(jié)果顯示 K562A/02細(xì)胞比 K562細(xì)胞中 PI3

10、K p110α蛋白、Phospho-Akt1蛋白、Phospho-IκBα蛋白、NF-κB p65蛋白、Phospho-NF-κB p65蛋白、P糖蛋白表達(dá)升高。不同濃度P100(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)作用K562A/02細(xì)胞后，可下調(diào)PI3K p110α蛋白、Phospho-Akt1蛋白、Phospho-IκBα蛋白、NF-κB p65蛋白、Phospho-NF-κB p65蛋白、P糖蛋白及Caspas

11、e9蛋白、Caspase8蛋白、Caspase3蛋白表達(dá)，并上調(diào)Fas蛋白、Cleaved Caspase9蛋白、Cleaved Caspase8蛋白、Cleaved Caspase3蛋白表達(dá)。
　　7.轉(zhuǎn)染MDR-1 shRNA抑制了K562A/02細(xì)胞P糖蛋白表達(dá)，增強(qiáng)了細(xì)胞對阿霉素的敏感性，與shRNA對照組(NC)比較， IC50值由17.13±3.05μmol/L降至9.28±0.53μmol/L；轉(zhuǎn)染NF-κB p65

12、 shRNA抑制了K562A/02細(xì)胞Phospho-NF-κB P65蛋白的表達(dá)，并下調(diào)了P糖蛋白表達(dá)，細(xì)胞對阿霉素的敏感性增加，與shRNA對照組(NC)比較，IC50值由17.13±3.05μmol/L降至11.53±1.52μmol/L。轉(zhuǎn)染Akt1 siRNA抑制了K562A/02細(xì)胞中Akt1基因及Phospho-Akt1蛋白的表達(dá)，而細(xì)胞中P糖蛋白表達(dá)和細(xì)胞對阿霉素的敏感性無改變，但是降低了NF-κB基因的表達(dá)。
　

13、　結(jié)論：P100能抑制多種腫瘤細(xì)胞及多藥耐藥細(xì)胞的體外增殖，在體內(nèi)對小鼠 H22肝癌移植瘤同樣有顯著的抑制作用，與陽性對照藥 VP-16相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)具有良好的理化性質(zhì)，水溶性較VP-16高100倍以上；(2)對正常細(xì)胞毒性較 VP-16明顯降低，體外抗腫瘤活性和抗瘤譜優(yōu)于VP-16；(3)對多藥耐藥細(xì)胞K562/A02的活性較VP-16高近5倍。P100不僅可以誘導(dǎo)K562凋亡而且還可以誘導(dǎo)多藥耐藥細(xì)胞K562/A02發(fā)生明

14、顯凋亡，相同劑量下VP-16僅能誘導(dǎo)K562凋亡而不能誘導(dǎo)K562/A02發(fā)生明顯凋亡。多藥耐藥細(xì)胞K562/A02與親本細(xì)胞K562之間在P糖蛋白及PI3K/Akt通路、NF-κB炎癥通路活化上有巨大差異，這提示耐藥表型P糖蛋白的表達(dá)與 PI3K/Akt通路及 NF-κB炎癥通路密切相關(guān)。而 P100對多藥耐藥細(xì)胞 K562A/02的作用機(jī)制可能與抑制 PI3K/Akt通路、抑制NF-κB通路導(dǎo)致P糖蛋白下調(diào)，另外啟動(dòng)Fas凋亡途徑及