鬼臼毒素衍生物GMZ-1體外抗腫瘤作用研究.pdf

1、目的:本文研究鬼臼毒素新型衍生物GMZ-1對腫瘤細(xì)胞的體外殺傷和抑制生長作用,并對其發(fā)揮作用的機(jī)制進(jìn)行初步探索。
　　 方法:
　　 1、MTT法檢測GMZ-1的體外抗腫瘤活性：
　　 采用MTT法測定GMZ-1對多種腫瘤細(xì)胞(Hela、A549、MCF-7、HepG－2,SKOV3、BGC-823,MGC-803,KB、KBV200、K562,K562/A02)及正常細(xì)胞(FB)抑制作用的IC50值。
　

2、　 2、GMZ-1誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的檢測：
　　 吉姆薩染色(Giemsa staining)和熒光染色(Heochst33342 staining)觀察GMZ-1 K562/A02細(xì)胞作用的形態(tài)學(xué)變化;瓊脂糖凝膠電泳觀察GMZ-1對KBV200細(xì)胞染色體DNA的影響;流式細(xì)胞術(shù)(FCM)測定經(jīng)GMZ-1處理后K562/A02細(xì)胞凋亡率的變化。
　　 3、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析GMZ-1對K562/A02細(xì)胞周期的影

3、響
　　 4、RT-PCR檢測GMZ-1對K562/A02細(xì)胞p21、p53、Bax、Caspase-3、PCNA、CyclinA、CyclinB1、Mdr-1基因mRNA表達(dá)的影響
　　 5、Western-blot檢測GMZ-1對K562/A02細(xì)胞Caspase-3、Mdr蛋白表達(dá)的影響
　　 6、GMZ-1對HepG-2細(xì)胞微管聚合的影響
　　 免疫熒光(Immunofluorescence)觀察

4、經(jīng)GMZ-1處理后HepG-2細(xì)胞微管形態(tài)變化;熒光半定量測定GMZ-1對HepG-2細(xì)胞微管聚合影響的抑制率及IC50值。
　　 7、小鼠急性毒性試驗(yàn)初步考察GMZ-1體內(nèi)毒性
　　 結(jié)果:
　　 1、GMZ-1的體外抗腫瘤活性：
　　 經(jīng)MTT法測定發(fā)現(xiàn)GMZ-1對多種腫瘤細(xì)胞均有較強(qiáng)殺傷作用和抑制生長活性,IC50值范圍為0.066μmol/L～0.27gmol/L,明顯強(qiáng)于同類已上市抗腫瘤藥物依托

5、泊苷(IC50值范圍為1.06μmol/L～14.1μmol/L),且對于同一種細(xì)胞的耐藥株與非耐藥株敏感性差別明顯弱于依托泊苷,有較好的抗多藥耐藥作用。同時(shí)對人正常成纖維細(xì)胞(FB)具有較低毒性,提示GMZ-1對腫瘤細(xì)胞有很好選擇性。通過繪制K562/A02細(xì)胞生長曲線,發(fā)現(xiàn)低濃度GMZ-1作用下細(xì)胞存活數(shù)量高于高濃度作用下的細(xì)胞存活數(shù)量,提示GMZ-1的作用具有一定的劑量依賴性。
　　 2、GMZ-1誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡：

6、>　　 GMZ-1能夠誘導(dǎo)K562/A02細(xì)胞凋亡,對經(jīng)過GMZ-1處理后的K562/A02細(xì)胞進(jìn)行染色(所用染料為Giemsa和Hoechst33342),并利用光學(xué)和熒光顯微鏡觀察。光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核染色質(zhì)發(fā)生聚集固縮,細(xì)胞核碎裂成多個(gè)染色濃密的凋亡小體;熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)同正常細(xì)胞微弱藍(lán)色熒光相比,GMZ-1處理組細(xì)胞出現(xiàn)強(qiáng)亮的藍(lán)色熒光,細(xì)胞核呈致密濃染。這些都是細(xì)胞發(fā)生凋亡的典型形態(tài),且高濃度GMZ-1處理后出現(xiàn)凋亡細(xì)胞的數(shù)

7、量多于低濃度。提取經(jīng)GMZ-1處理后KBV200細(xì)胞的總DNA,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,發(fā)現(xiàn)其泳道呈一條一條的梯子狀,為細(xì)胞發(fā)生凋亡所出現(xiàn)的典型的“DNA梯子”(DNA ladder)。通過流式細(xì)胞儀對GMZ-1處理后的K562/A02細(xì)胞凋亡率的測定,發(fā)現(xiàn)在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi),GMZ-1處理后的細(xì)胞凋亡率高于正常細(xì)胞凋亡率,且凋亡率隨著濃度的增大和時(shí)間的增多而變大。
　　 3、GMZ-1對K562/A02細(xì)胞增值周期的影響：

8、r>　　 采用流式細(xì)胞儀分析了經(jīng)GMZ-1處理后K562/A02細(xì)胞的周期分布情況,結(jié)果顯示,在一定濃度范圍內(nèi),GMZ-1作用12h、24h、36h,細(xì)胞都發(fā)生G2+M期阻滯。
　　 4/GMZ-1對K562/A02細(xì)胞凋亡相關(guān)基因p21、p53、Bax、Caspase-3,增殖細(xì)胞核抗原PCNA,細(xì)胞周期素CyclinA、CyclinB1,多藥耐藥基因Mdr-1等mRNA表達(dá)的影響:
　　 RT-PCR分析結(jié)果顯示,

9、GMZ-1通過上調(diào)抑癌基因p21、p53、BaxmRNA的表達(dá)而發(fā)揮誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用;通過上調(diào)CyclinA,下調(diào)CyclinB1、PCNA而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞分裂增殖的作用;通過下調(diào)Mdr-1基因mRNA的表達(dá)而產(chǎn)生抗多藥耐藥作用。
　　 5、GMZ-1對K562/A02細(xì)胞凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3和耐藥蛋白Mdr表達(dá)的影響：
　　 通過Western-blot分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),GMZ-1能下調(diào)Mdr蛋白的表達(dá),

10、進(jìn)而發(fā)揮抗多藥耐藥的作用。而對K562/A02細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)影響不明顯。
　　 6、GMZ-1對HepG-2細(xì)胞微管聚合的影響：
　　 通過免疫熒光方法觀察到正常HepG-2細(xì)胞微管呈致密的網(wǎng)狀分布,熒光強(qiáng)度高,細(xì)胞立體感強(qiáng),而經(jīng)過GMZ-1處理后的微管,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)稀疏或消失,呈星點(diǎn)狀分布,熒光強(qiáng)度明顯減弱,說明HepG-2細(xì)胞微管發(fā)生了解聚。通過免疫熒光半定量法對微管聚合解聚動態(tài)平衡進(jìn)行測定,結(jié)果顯示GMZ

11、-1對微管具有很強(qiáng)的抑制作用,其抑制作用的IC50值為0.066±0.007μmol/L,同鬼臼毒素的0.071±0.007μmol/L相差不大,同時(shí)GMZ-1各濃度對應(yīng)抑制率正負(fù)值同長春新堿相似,說明GMZ-1可能和長春新堿一樣發(fā)揮抑制微管聚合的作用。
　　 7、GMZ-1急性毒性試驗(yàn)：
　　 昆明小鼠腹腔注射GMZ-1后觀察到小鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、蜷縮不活動、相繼出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,解剖死亡小鼠后發(fā)現(xiàn)大腸或小腸有阻塞,通過各組

12、小鼠最后死亡數(shù)量計(jì)算得GMZ-1腹腔注射的LD50值為97.90±19.21 mg/kg(95％confidence interval)。
　　 結(jié)論:GMZ-1在體外對多種腫瘤細(xì)胞均具有較強(qiáng)的殺傷作用,其對多數(shù)腫瘤細(xì)胞的IC50值在0.10μmol/L左右,活性強(qiáng)于依托泊苷10-100倍。多項(xiàng)試驗(yàn)證明GMZ-1對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用可能是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方式實(shí)現(xiàn)的。GMZ-1能影響腫瘤細(xì)胞正常分裂周期,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖