鬼臼毒素衍生物YB-L1EPO的抗多藥耐藥腫瘤細(xì)胞作用及其作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:本研究室通過對(duì)鬼臼進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，得到一系列結(jié)構(gòu)新穎的衍生物，其中YB-L1EPO在體外具有顯著的抗多藥耐藥腫瘤活性，且具有良好的量效關(guān)系。本文進(jìn)一步研究了YB-L1EPO對(duì)體外培養(yǎng)的多藥耐藥腫瘤細(xì)胞和動(dòng)物移植性腫瘤的抑制作用及特點(diǎn)，并初步探討了它的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、MTT法和SRB法檢測(cè)YB-L1EPO的抗敏感腫瘤及多藥耐藥腫瘤活性。
　　 用96孔培養(yǎng)板接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩株多藥耐藥腫瘤細(xì)

2、胞（K562/A02和KBv200）、多種敏感的人源性腫瘤細(xì)胞和人的血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）及成纖維細(xì)胞（fb），培養(yǎng)24h后，加YB-L1EPO（10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L、0.01μmol/L），36h后MTT法和SRB法測(cè)定YB-L1EPO在體外對(duì)各種腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞的IC50及GI50值。用SRB法檢測(cè)藥物對(duì)K562和K562/A02細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響。
　　 2、光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡觀察YB

3、-L1EPO作用后多藥耐藥腫瘤細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。
　　 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562/A02細(xì)胞中加入不同濃度YB-L1EPO，作用24h后進(jìn)行Giemsa染色和Hoechst33342染色，前者用光學(xué)顯微鏡觀察照相并保留結(jié)果；后者以紫外光（340nm）激發(fā)Hoechst，熒光顯微鏡觀察照相并保留結(jié)果。
　　 3、觀察YB-L1EPO對(duì)動(dòng)物移植性腫瘤的抑制作用。
　　 昆明小鼠體內(nèi)移植實(shí)體型S180肉瘤，接種S180肉瘤

4、24h后，連續(xù)給YB-L1EPO（35mg/kg/d和70 mg/kg/d）6 d，于7d處死動(dòng)物，剝離腫瘤并稱重，觀察YB-L1EPO對(duì)實(shí)體瘤S180肉瘤的治療作用。
　　 4、瓊脂糖凝膠電泳分析YB-L1EPO對(duì)K562/A02細(xì)胞染色體DNA斷裂的影響。
　　 在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562/A02細(xì)胞中加入不同濃度YB-L1EPO（0.05、0.1、0.2μmol/L）作用24h后抽提樣本DNA，于1.5％瓊脂糖膠電泳，電

5、泳完成后用紫外光下觀察并照相。D-24851（0.2μmol/L）作為陽性對(duì)照。
　　 5、流式細(xì)胞術(shù)分析YB-L1EPO對(duì)K562/A02細(xì)胞周期的影響和誘導(dǎo)凋亡率的變化。
　　 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562/A02細(xì)胞，加入YB-L1EPO（0.1μmol/L和0.4μmol/L），用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度的YB-L1EPO作用24 h、36h和48 h后對(duì)K562/A02細(xì)胞的影響。
　　 6、 RT-PCR法檢

6、測(cè)不同濃度YB-L1EPO（0.05、0.1、0.2μmol/L）對(duì)K562/A02細(xì)胞mdr-1、p53、bcl-2、bax、p21、caspase3mRNA表達(dá)的影響。
　　 7、免疫組化法觀察不同濃度YB-L1EPO（0.05、0.1、0.2μmol/L）對(duì)K562/A02細(xì)胞膜P-gp蛋白表達(dá)的影響。
　　 8、Western-blot法檢測(cè)不同濃度YB-L1EPO（0.05、0.1、0.2μmol/L）對(duì)K56

7、2/A02細(xì)胞P-gp蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1、YB-L1EPO的體外抗腫瘤作用
　　 通過體外MTT和SRB方法發(fā)現(xiàn)YB-L1EPO對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有較好的抑制作用，IC50為0.04μmol/L～0.69μmol/L；而且抑制多藥耐藥腫瘤細(xì)胞的效果也非常顯著。其對(duì)K562/A02和KBv200的GI50分別為0.08μmol/L和0.11μmol/L；單從體外的MTT結(jié)果來看，YB-L1EP

8、O對(duì)癌細(xì)胞與正常細(xì)胞具有較好的選擇性，對(duì)人的血管內(nèi)皮細(xì)胞（VEC）和成纖維細(xì)胞（fb）的IC50均>10μmol/L。通過對(duì)K562/A02細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的觀察，發(fā)現(xiàn)隨著給藥劑量的加大，YB-L1EPO對(duì)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用越來越明顯。YB-L1EPO的抗腫瘤活性與鬼臼毒素相當(dāng)，IC50在同一數(shù)量級(jí)，且具有顯著的抗多藥耐藥腫瘤細(xì)胞的活性。
　　 2、YB-L1EPO的體內(nèi)抗腫瘤作用
　　 連續(xù)腹腔注射YB-L1E

9、PO（35mg/kg/d及70mg/kg/d）10d，對(duì)小鼠實(shí)體型肉瘤S180的生長(zhǎng)抑制率分別為33.6％和48.0％，大劑量和小劑量與對(duì)照組相比均具有顯著性差異（P<0.05），且各劑量組小鼠體重與對(duì)照組小鼠體重?zé)o顯著性差異（P>0.05）。說明YB-L1EPO在體內(nèi)試驗(yàn)表現(xiàn)出良好的腫瘤抑制作用，且無明顯毒副作用。
　　 3、YB-L1EPO對(duì)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞周期的影響
　　 本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀分析了YB-L1EPO

10、對(duì)K562/A02細(xì)胞周期移行的影響。經(jīng)不同濃度的YB-L1EPO（0.05μmol/L、0.2μmol/L）作用于K562/A02細(xì)胞24h、36h、48h后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞各時(shí)相都有所抑制的同時(shí)，24h、36h時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞周期被阻斷在S期，而48h時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞周期被阻斷在G1期。這說明YB-L1EPO作用24h、36h后，藥物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞被阻滯在DNA合成期；而作用48h后，細(xì)胞在DNA合成前就被阻滯。
　　 4、YB-L1

11、EPO誘導(dǎo)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞凋亡
　　 YB-L1EPO能夠誘導(dǎo)K562/A02細(xì)胞凋亡。不同濃度的YB-L1EPO（0.05μmol/L、0.1μmol/L）.作用于K562/A02細(xì)胞24小時(shí)后，用熒光染料Hoechst33342對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，在紫外光（340nm）激發(fā)下發(fā)出藍(lán)色熒光。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)YB-L1EPO可使細(xì)胞核染色質(zhì)發(fā)生聚集、碎裂，細(xì)胞核固縮呈均一的致密物，進(jìn)而斷裂，細(xì)胞膜不斷出芽、脫落，細(xì)胞變成數(shù)個(gè)大小

12、不等的凋亡小體，并且隨著給藥濃度的加大，鏡下這種細(xì)胞形態(tài)的變化愈來愈明顯，表明凋亡細(xì)胞的比例逐漸增加。在DNA凝膠電泳實(shí)驗(yàn)中，用不同濃度的YB-L1EPO（0.05、0.1、0.2μmol/L）作用于K562/A02細(xì)胞24小時(shí)，提取DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，呈現(xiàn)“DNA梯子”（DNA ladder）。流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞的DNA含量測(cè)定，可見不同濃度的YB-L1EPO（0.05μmol/L和0.2μmol/L）作用于K562/A02細(xì)胞

13、24小時(shí)后，即開始出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，且凋亡細(xì)胞的比例隨著YB-L1EPO濃度的升高和作用時(shí)間韻延長(zhǎng)而增加，呈一定的劑量與時(shí)間依賴性。從以上三方面的結(jié)果可以認(rèn)為YB-L1EPO能夠誘導(dǎo)多藥耐藥腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　 5、YB-L1EPO對(duì)多藥耐藥性基因mdr-1、凋亡相關(guān)基因p53、bcl-2、bax、p21、caspase3表達(dá)及mdr-1編碼的蛋白P-gp表達(dá)的影響
　　 本實(shí)驗(yàn)觀察了YB-L1EPO對(duì)mdr-1基因及凋亡相

14、關(guān)基因p53、bcl-2、bax、p21和caspase3的mRNA表達(dá)的影響。經(jīng)不同濃度的YB-L1EPO（0.05、0.1、0.2μmol/L）作用于K562/A02細(xì)胞24dx時(shí)，RT-PCR結(jié)果顯示YB-L1EPO可增加p53、p21、caspase3及bax的mRNA表達(dá)，同時(shí)降低了bcl-2和mdr-1mRNA的表達(dá)，結(jié)果同對(duì)照組相比均有顯著性差異（P），且呈一定的劑量依賴性。提示YB-L1EPO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用極可能依靠

15、上調(diào)了p53、p21、caspase3以及Bax的mRNA表達(dá)，同時(shí)協(xié)同下調(diào)抑制凋亡基因Bcl-2和多藥耐藥性基因mdr-1 mRNA的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。本實(shí)驗(yàn)觀察了YB-L1EPO對(duì)多藥耐藥相關(guān)蛋白P-gp表達(dá)的影響。經(jīng)不同濃度的MS-275-6（0.05、0.1、0.2μmol/L）作用于K562/A02細(xì)胞24小時(shí)，免疫組化及western blot結(jié)果顯示YB-L1EPO可使P-gp蛋白的表達(dá)量降低，且呈一定的劑量