京尼平對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞吐的抑制作用與其分子機(jī)制.pdf

1、血管內(nèi)皮細(xì)胞位于血管內(nèi)腔表面,是血管壁與血液之間的分界屏障細(xì)胞。它不僅是生物學(xué)上的結(jié)構(gòu)與功能屏障,還是高度活躍的代謝庫,能合成多種血管活性物質(zhì)。血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能異常與多種疾病的發(fā)生相關(guān)或?yàn)槭紕?dòng)環(huán)節(jié),尤其在心腦血管性疾病發(fā)病過程中起到重要作用。在血管內(nèi)皮細(xì)胞功能異常和損傷發(fā)生過程中,血管內(nèi)皮細(xì)胞胞吐是最早發(fā)生的反應(yīng)。血管內(nèi)皮細(xì)胞受到炎癥刺激時(shí),它通過胞吐釋放大量炎癥性因子,誘導(dǎo)大量的白細(xì)胞、血小板粘附到血管內(nèi)皮表面,加劇組織炎癥與

2、血栓的形成。內(nèi)皮細(xì)胞胞吐已經(jīng)成為研究血管功能異常和損傷發(fā)生機(jī)制的一個(gè)重要方面。
　　 內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)貯存大量的顆粒,它們包含前炎癥因子與前凝血因子,例如:P-選擇素(P-selectin)、E-選擇素(E-selectin)、血管內(nèi)皮粘附分子-1(VCAM-1)和血管假性血友病因子(VWF)等,這些分子與細(xì)胞粘附、炎癥及止血緊密相關(guān)。P-選擇素介導(dǎo)中性粒細(xì)胞在活化內(nèi)皮細(xì)胞上的滾動(dòng),尤其在炎癥過程的早期(數(shù)分鐘)甚為重要,在炎癥晚期同

3、其他選擇素分子協(xié)同發(fā)揮作用。P-選擇素還參與血小板和某些T細(xì)胞亞群的沿血管壁的滾動(dòng)的過程。E-選擇素主要介導(dǎo)白細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和CD4+記憶性T細(xì)胞)在內(nèi)皮細(xì)胞表面最初的滯留和滾動(dòng),以及隨后遷移到炎癥的組織。血管內(nèi)皮粘附分子-1主要介導(dǎo)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞嗜酸細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。它特異地與白細(xì)胞(除中性粒細(xì)胞外)所產(chǎn)生的整合素家族的粘附因子VLA-4結(jié)合,介導(dǎo)細(xì)胞粘附和信號(hào)傳遞,在細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病病理

4、生理過程中發(fā)揮作用。血管假性血友病因子介導(dǎo)血小板粘附與聚集,啟動(dòng)血栓形成,特異性地反映血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的異常。許多促分泌劑都能刺激內(nèi)皮細(xì)胞胞吐,例如:凝血酶,組胺,白三烯,補(bǔ)體等。根據(jù)胞吐是由鈣介導(dǎo)還是CAMP介導(dǎo),促分泌劑分為兩類。目前研究最廣的是凝血酶,它是一種鈣調(diào)促分泌劑,它通過活化鈣調(diào)蛋白升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度,導(dǎo)致快速的胞吐。凝血酶與位于內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放P-selectin、E-selectin和VCA

5、M-1,這一系列反應(yīng)不僅推動(dòng)凝血過程和血小板黏附,而且促進(jìn)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞在內(nèi)皮下聚集,進(jìn)一步使內(nèi)皮細(xì)胞活化,刺激內(nèi)皮收縮、通透性增加、黏附分子表達(dá)增加、白細(xì)胞滾動(dòng)和穿透力加強(qiáng)。凝血酶刺激內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)成為研究血管內(nèi)皮損傷機(jī)制的一個(gè)重要模型。
　　 內(nèi)皮細(xì)胞的每個(gè)運(yùn)輸小泡的胞吐都經(jīng)歷裝載,出芽,移位,對接,誘發(fā),膜融合,及再循環(huán)這幾個(gè)階段。幾套蛋白調(diào)節(jié)小泡的轉(zhuǎn)運(yùn),包括Rab家族成員,N-乙基順丁烯二酰亞胺敏感性的融合

6、蛋白(NSF),可溶性的NSF附著蛋白,SNAP受體蛋白(SNAREs),Sec/Munc家族。NSF是調(diào)節(jié)胞吐的重要分子。它是由六個(gè)相同的亞基組成的六聚體,每個(gè)業(yè)基的分子量約85kD,各含三個(gè)結(jié)構(gòu)域,分別命名為N、D1、D2結(jié)構(gòu)域。NSF只有在三個(gè)結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用時(shí)才能最大限度地發(fā)揮自己的功能,其中N結(jié)構(gòu)域主要與SNARE復(fù)合物結(jié)合,D1的ATP酶活性是NSF的主要功能,D2主要參與多聚體的形成,球形的N結(jié)構(gòu)域環(huán)繞于環(huán)的外側(cè)基底部。一氧

7、化氮主要通過巰基業(yè)硝基化NSF的D1結(jié)構(gòu)域的C264位的半胱氨酸殘基,阻止NSF與SNAREs的解離,從而阻止胞吐。因此增加一氧化氮的產(chǎn)生就可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的胞吐,從而抑制細(xì)胞粘附,減緩血管炎癥與血栓形成在內(nèi)皮細(xì)胞。在內(nèi)皮細(xì)胞,一氧化氮主要由內(nèi)皮型一氧化氮合酶催化精氨酸合成一氧化氮。內(nèi)皮型一氧化氮合酶的活化主要由磷脂酰肌醇3激酶.絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt(PI3K-Akt)信號(hào)通路調(diào)控。磷脂酰肌醇3激酶被激活后,在細(xì)胞膜上生成第二信使

8、磷脂酰肌醇4,5二磷酸(PIPa),PIPa與細(xì)胞內(nèi)含有PH結(jié)構(gòu)域的信號(hào)蛋白Akt和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶結(jié)合,促使磷酸肌醇依賴性蛋白激酶磷酸化Akt蛋白的Ser308導(dǎo)致Akt的活化,Akt激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶,導(dǎo)致NO的產(chǎn)生。此外,內(nèi)皮細(xì)胞粘附性增加,血管炎癥發(fā)生也與炎癥因子誘導(dǎo)的粘附分子大量表達(dá)密切相關(guān)。核因子-kappa B(NF-к B)信號(hào)通路調(diào)控許多粘附分子的表達(dá)。粘附分子VCAM-1和E-selectin基因的啟動(dòng)子區(qū)

9、域存在NF-к B的結(jié)合位點(diǎn)。NF-к B是一種普遍存在于各種細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子。NF-к B由兩類亞基形成同源或異源二聚體。一類亞基包括p65(也稱RelA)、RelB和C-Rel；另一類亞基包括p50和p52。最常見的NF-к B亞基組成形式為p65/p50或p65/p65。在正常狀態(tài)下,NF-к B在胞質(zhì)中與它的抑制因子-к B(I к B)結(jié)合在一起,失去轉(zhuǎn)錄活性。在炎癥因子如凝血酶激活存在的情況下,I к B-α?xí)赟er32

10、和Ser36被磷酸化,隨后被泛素-蛋白酶體途徑降解。NF-к B和I к B-α解聚后,其核定位序列被暴露,從而被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi),在核內(nèi)與目的基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,促進(jìn)NF-к B依賴的基因轉(zhuǎn)錄。
　　 京尼平是桅子果實(shí)中的主要成分之一梔子苷在腸和肝中的水解產(chǎn)物,是梔子苷的苷元。梔子是我國的一種傳統(tǒng)中藥,具有瀉火除煩,清熱利尿,涼血散瘀的功效,被用于治療熱病心煩、火毒瘡瘍、外治扭挫傷痛、消渴目赤等癥,在中醫(yī)處方中應(yīng)用甚廣。梔子含

11、有多種化學(xué)成分,藥理實(shí)驗(yàn)表明,以梔子苷為代表的烯醚萜類成分為梔子的主要活性成分,它具有利膽、鎮(zhèn)痛、保肝、抗癌、抗炎等作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)梔子苷在體內(nèi)的主要活性產(chǎn)物是京尼平。京尼平具有明顯的抗炎與抗血栓作用。但作用機(jī)制尚不清楚,然而內(nèi)皮細(xì)胞胞吐與抗炎和抗血栓有著密切的聯(lián)系,提示我們京尼平可能具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞胞吐作用。
　　 基于上述背景我們確定研究京尼平對人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilicalvein endothel

12、ail cell,HUVEC)胞吐的作用及其機(jī)制。我們首先觀察京尼半對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用,以確定下一步實(shí)驗(yàn)京尼平的合適劑量,用于研究京尼平對凝血酶誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞胞吐的抑制作用。然后在細(xì)胞水平研究京尼平對凝血酶誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)細(xì)胞與單核細(xì)胞的粘附抑制作用,以及在動(dòng)物整體水平研究京尼平對小鼠尾靜脈出血時(shí)間的影響。最后從一氧化氮的產(chǎn)生,磷脂酰肌醇3激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt(PI3K-Akt)信號(hào)通路和核因子-kappa

13、B信號(hào)通路的作用來研究京尼平抑制胞吐的分子機(jī)制。
　　 結(jié)論:
　　 一、首次發(fā)現(xiàn)京尼平抑制凝血酶誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞粘附分子、選擇素和血管假性血友病因子的胞吐。
　　 二、京尼平減少凝血酶誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的粘附,并且明顯延長小鼠尾靜脈出血時(shí)間。
　　 三、京尼平通過激活PI3K,誘導(dǎo)Akt的磷酸化從而激活eNOS,增加一氧化氮的產(chǎn)生,促進(jìn)NSF蛋白巰基亞硝基化,從而發(fā)揮抑制胞吐的作

14、用。
　　 四、京尼平明顯抑制凝血酶誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1和E-selectin mRNA和蛋白的表達(dá)以及細(xì)胞核因子-к B信號(hào)通路的活化。
　　 綜上所述,京尼平通過活化PI3K-Akt-eNOS信號(hào)通路,增加一氧化氮的產(chǎn)生,促進(jìn)NSF蛋白巰基亞硝基化,從而發(fā)揮抑制胞吐的作用。同時(shí)它也能抑制核因子-к B信號(hào)通路從而抑制粘附分子的表達(dá)。京尼平通過影響上述兩條通路,共同發(fā)揮抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞的粘附