SARS-CoV S、N、E和M DNA免疫的細(xì)胞免疫應(yīng)答.pdf

1、SARS(SevereAcuteRespiratorySyndrome)是一種傳染性強(qiáng)、病死率高、嚴(yán)重危害人民生命健康的傳染病。世界衛(wèi)生組織于2003年4月6日宣布引起SARS的病原體是一種新的病毒，屬于冠狀病毒家族，稱為SARS相關(guān)冠狀病毒(SARS-Associatedcoronavirus，SARS-CoV)。SARS-CoV表現(xiàn)出許多不同于冠狀病毒的特性，為冠狀病毒中一個(gè)新的分支。目前，病毒性疾病尚無特效治療方法，對(duì)于SARS也

2、是一樣。所以，控制SARS的最好辦法是預(yù)防，而疫苗的開發(fā)則是建立有效防范措施的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。DNA疫苗是繼滅活疫苗、亞單位疫苗之后的第三代疫苗，具有許多的優(yōu)越性。所以本研究選擇了SARS病毒DNA疫苗這一方向，以SARS-CoV主要結(jié)構(gòu)蛋白S、N、E和M蛋白基因作為研究對(duì)象。構(gòu)建針對(duì)SARS-CoV結(jié)構(gòu)蛋白基因的重組核酸疫苗，觀察其免疫小鼠后機(jī)體的特異性免疫應(yīng)答的情況，探討其作為SARS-CoV疫苗的可能性。 本研究由兩部分組成：

3、 第一部分為SARS-CoV結(jié)構(gòu)蛋白基因重組核酸疫苗的構(gòu)建。從GenBank上獲得SARS(BJ01)S、N、E和M蛋白基因的序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer6.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。以SARS-CoV(BJ01)cDNA為模板，合適條件下進(jìn)行PCR，獲得SARS-CoVSARS-CoVS、N、E和M蛋白基因片段。經(jīng)酶切處理后，定向克隆于pVAX1真核表達(dá)載體，構(gòu)建包含SARS-CoVS、N、E和M基因片段的重組質(zhì)粒pVAX/S、pV

4、AX/N、pVAX/E和pVAX/M。經(jīng)酶切和測(cè)序等方法鑒定重組質(zhì)粒的正確性。然后利用間接免疫熒光法鑒定重組質(zhì)粒的體外表達(dá)。將重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞。48小時(shí)后IFA試驗(yàn)檢測(cè)目的基因的表達(dá)產(chǎn)物的活性。 第二部分為真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX/S、pVAX/N、pVAX/E和pVAX/M在小鼠體內(nèi)的免疫原性研究。將重組質(zhì)粒按100ug/只肌肉注射BALB/c小鼠，第一次免疫后2周進(jìn)行加強(qiáng)免疫，4周后進(jìn)行第三次免疫。試驗(yàn)分為空載體組，實(shí)驗(yàn)