SARS-CoV N蛋白基因的克隆及其在裂殖酵母中的表達.pdf

1、嚴重急性呼吸道綜合癥即為人們所熟知的SARS(SevereAcuteRespiratorySyndrome)，是2002年11月在我國南方首次發(fā)現(xiàn)的一種新型的呼吸道傳染病，短短幾個月內(nèi)傳播到世界多個地區(qū)。由于其傳染性強，發(fā)病快，病癥重，病死率高，不易控制，對人民群眾的生命財產(chǎn)和經(jīng)濟利益造成了巨大的損失。2003年4月，在世界衛(wèi)生組織及多國科學家的共同努力下，SARS的病原體被確診為一種新型的冠狀病毒。 雖然SARS病情已于200

2、3年7月得到了基本控制，但這種疾病的病因、病原體的來源、治療該病的藥物、用于預防的疫苗等都未得到很好的解決。如何更好地認識SARS、攻克SARS成為科學家們急需解決的問題。研究SARS病毒(SARS-CoV)的主要結(jié)構(gòu)蛋白對于認清其致病機理、尋找其治療和預防藥物具有重要的意義。該課題采用基因工程的方法，利用真核表達系統(tǒng)來研究SARS-CoV核衣殼蛋白(N蛋白)的表達，以便為開展N蛋白的相關研究打下基礎。 由SARS-CoV的RN

3、A反轉(zhuǎn)錄出cDNA。利用巢式PCR以cDNA為模板，特異擴增出N蛋白基因。經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠分離后，切膠回收N蛋白基因，連接至pMD18-T載體后測序。序列輸入GenBank進行比對，確定為SARS-CoV的N蛋白基因，獲得含有目的基因的重組載體pMD18-T-N。 設計包含Kozak序列的引物，從重組載體pMD18-T-N上擴增N蛋白基因，電泳分離、切膠回收后與裂殖酵母表達載體pNMT1-TOPO進行A-T克隆。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T

4、OP10感受態(tài)細菌，含氨芐青霉素的LB平板進行篩選。生長出的單克隆經(jīng)菌落PCR初步鑒定為陽性克隆后，擴大培養(yǎng)，提取重組載體測序鑒定。測序結(jié)果進行序列比對，確定構(gòu)建正確的裂殖酵母重組真核表達載體pNMT1-TOPO-N 經(jīng)測序鑒定的陽性TOP10克隆擴大培養(yǎng)，提取重組表達載體。純化后，經(jīng)電擊儀電轉(zhuǎn)化裂殖酵母TCP1。用含硫胺素的亮氨酸營養(yǎng)缺陷性基本培養(yǎng)基(EMM+T)進行篩選，生長出的單克隆進行菌落PCR鑒定。在EMM+T液體培養(yǎng)

5、基中接種陽性重組酵母克隆，30℃搖床振搖培養(yǎng)過夜。收集菌體，用蒸餾水及EMM進行洗滌除去硫胺素殘余物后，接種一小份至EMM表達培養(yǎng)基中誘導表達。30℃搖床振搖培養(yǎng)18小時，離心收集菌體，破壁后收集上清。 上清中的N蛋白先用SDS-PAGE電泳進行大小鑒定。在10％的分離膠中得到一條大約47kD的蛋白條帶。然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(NC)上，進行Western-blot分析，同樣得到一條特異的大小約為47kD的條帶。表明已利用重組表