辛伐他汀對非灑精性脂肪性肝纖維化的影響及其分子機制.pdf

1、目的：非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征，包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎(NASH)和脂肪性肝硬化。在我國，NAFLD已成為慢性肝病的常見類型。非酒精性脂肪性肝纖維化作為NAFLD發(fā)病的中間階段，其具體發(fā)生機制尚未完全闡明。脂聯(lián)素是脂肪細胞分泌的一種保護性脂肪因子，可通過活化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和激活p38有絲分裂原活化蛋白激酶，發(fā)揮抗炎、

2、改善胰島素抵抗、促進脂肪酸氧化等作用。目前研究顯示，脂聯(lián)素具有抗纖維化作用，能夠抑制肝星狀細胞（HSC）活化、增殖、遷移，促進活化HSC凋亡，但其具體機制不明。一氧化氮合酶(NOS)是合成一氧化氮的限速酶，脂聯(lián)素能增強內(nèi)皮型NOS(eNOS)的活性，抑制血管內(nèi)皮細胞收縮。但脂聯(lián)素能否通過調(diào)節(jié)NOS表達抑制HSC活化尚不得知。辛伐他汀是臨床常用的降血脂藥物，隨著研究深入，其非降脂作用日益受到重視，如抗炎、抗氧化、抑制細胞增殖等。研究顯示，

3、辛伐他汀能降低NAFLD患者的血脂水平，減輕肝組織脂肪變性程度，但其能否提高NAFLD患者血清脂聯(lián)素水平、上調(diào)肝組織脂聯(lián)素表達、抑制或延緩肝纖維化進展仍有爭議。因此，本研究應(yīng)用高脂飲食建立非酒精性脂肪性肝纖維化大鼠模型，通過檢測血清脂聯(lián)素水平，肝組織脂聯(lián)素、AMPKmRNA和蛋白含量，觀察模型大鼠中脂聯(lián)素、AMPK和NOS的表達變化及意義；體外培養(yǎng)HSC，明確外源性脂聯(lián)素對HSC中AMPK、NOS表達的影響；并通過體內(nèi)外實驗觀察辛伐他汀

4、對模型大鼠肝組織及體外培養(yǎng)HSC中脂聯(lián)素、NOS表達的影響，從整體、組織、細胞及分子水平探討辛伐他汀對非酒精性脂肪性肝纖維化的可能作用機制，為臨床有效防治非酒精性脂肪性肝纖維化提供新的理論依據(jù)及治療靶點。
　　 方法：
　　 1、脂聯(lián)素在非酒精性脂肪性肝纖維化大鼠肝臟中的表達及意義
　　 健康雄性清潔級Wistar大鼠40只，體重（150±10）g，由河北醫(yī)科大學動物實驗中心提供。正常喂養(yǎng)1周后隨即分為正常對照組

5、和模型組，其中正常對照組大鼠10只，以標準飼料喂養(yǎng)，模型組大鼠30只，以高脂飲食喂養(yǎng)（標準飼料基礎(chǔ)上加2％膽固醇、10％豬油和5％玉米油）。分別于第8、12、16、20、24周末隔夜空腹處死模型組大鼠各6只，迅速采血并留取肝組織標本。應(yīng)用全自動生化分析儀測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平；酶聯(lián)免疫吸附測定( ELISA)法檢測血清脂聯(lián)素水平；取部分新鮮肝組織立即冰凍切片

6、，進行蘇丹Ⅳ染色以觀察肝組織脂肪變性情況；另取部分肝組織以10％福爾馬林固定并制作石蠟切片，分別行蘇木素-伊紅(HE)染色和Masson三重染色，以觀察肝組織普通病理改變及纖維化程度；余肝組織-80℃保存，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測脂聯(lián)素、AMPK、Ⅰ型膠原mRNA的表達，用蛋白印記法( Western Blot)測定脂聯(lián)素、AMPK、磷酸化AMPK(p-AMPK)、Ⅰ型膠原蛋白的表達變化。
　　 2、脂聯(lián)素抑制肝

7、星狀細胞活化的分子機制
　　 人肝星狀細胞株LX-2細胞購自中科院細胞庫。將處于對數(shù)生長期的LX-2細胞接種在六孔板中，每孔5×105個細胞，用含10％胎牛血清和1％青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)至70％融合時換用促進脂肪細胞分化的培養(yǎng)基（adipogenic differentiation mixture，ADM，含10％胎牛血清、1％青鏈霉素、0.5mM異丁基甲基黃嘌呤、1μM地塞米松和1μM胰島素的低糖DMEM）培養(yǎng)72h，獲

8、得靜止型LX-2細胞，用含0.2％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)24h，使細胞同步化。對照組常規(guī)培養(yǎng)并加入溶劑，處理組在常規(guī)培養(yǎng)基礎(chǔ)上分別加入TGF-β1(100pM)、脂聯(lián)素(5μg/ml)、TGF-β1(100pM)+脂聯(lián)素(5μg/ml)、NOS抑制劑L-NAME(100μM)、L-NAME(100μM)+脂聯(lián)素(5μg/ml)處理1h（用于檢測AMPK表達情況）或24h．收取細胞。RT-PCR和Westem Blot法分別檢測各組LX-

9、2細胞中AMPK、誘導型NOS(iNOS)、eNOS、α平滑肌動蛋白(α-SMA)和Ⅰ型膠原mRNA和蛋白的表達。
　　 3、辛伐他汀對非酒精性脂肪性肝纖維化的治療作用及其機制
　　 體內(nèi)實驗：健康雄性清潔級Wistar大鼠18只，體重（150±10）g，由河北醫(yī)科大學動物實驗中心提供。正常喂養(yǎng)1周后隨即分為正常對照組6只，以標準飼料喂養(yǎng)，模型組12只，以高脂飲食喂養(yǎng)（標準飼料基礎(chǔ)上加2％膽固醇、10％豬油和5％玉米油）

10、。于第16周末從模型組大鼠中隨機隨機分出6只大鼠為辛伐他汀干預組，在高脂飲食基礎(chǔ)上加用辛伐他汀(4mg·kg-1·d-1)灌胃，余大鼠采用生理鹽水灌胃，均于第24周末隔夜空腹處死，留取血清及肝組織標本。應(yīng)用全自動生化分析儀測定血清ALT、AST、TC、TG水平；ELISA法檢測血清脂聯(lián)素水平；HE染色、蘇丹Ⅳ染色和Masson三重染色分別觀察肝組織炎癥、脂肪變性及纖維化程度；RT-PCR法和Western Blot法測定肝組織脂聯(lián)素、e

11、NOS、Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達的變化。
　　 體外實驗：LX-2細胞的準備同第二部分。LX-2細胞的對照組加入溶劑，處理組分別加入TGF-β1(100pM)、辛伐他汀(10μM)、TGF-β1(100pM)+辛伐他?。?0μM）、L-NAME（100μM）、L-NAME（100μM）+辛伐他?。?0μM）處理24h，收取細胞。另準備LX-2細胞做如下實驗：對照組加入溶劑，處理組加入不同濃度辛伐他?。?μM，2.5μM，5μM

12、，10μM）處理24h后收取細胞；或加入10μM辛伐他汀作用不同的時間(1h，1.5h，3h，6h，12h，24h)，觀察辛伐他汀對LX-2細胞中脂聯(lián)素表達的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、脂聯(lián)素在非酒精性脂肪性肝纖維化大鼠肝臟中的表達及意義
　　 1.1模型大鼠血清生化指標和脂聯(lián)素的變化：隨著造模時間延長，模型組大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平逐漸升高，脂聯(lián)素水平逐漸降低，與對照組相比P＜0.05或P＜0

13、.01，并且血清ALT、AST、TC、TG水平與脂聯(lián)素水平負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.58、-0.52、-0.55和-0.45，P值均＜0.01。
　　 1.2肝組織病理學改變：模型組大鼠肝組織鏡下表現(xiàn)為肝細胞濁腫、氣球樣變，伴小葉內(nèi)混合性炎癥細胞浸潤、可見點、灶狀壞死，腫脹的肝細胞出現(xiàn)中、重度脂肪變性，以中央靜脈周圍最為明顯。隨造模時間延長，肝細胞脂肪變性及小葉內(nèi)炎癥逐漸加重。第16周末，部分模型大鼠肝組織出現(xiàn)少量竇周纖維化，

14、至24周末模型組大鼠均出現(xiàn)明顯竇周纖維化，部分可見中央靜脈周圍和匯管區(qū)纖維化。
　　 1.3大鼠肝組織脂聯(lián)素、AMPK和Ⅰ型膠原mRNA和蛋白的表達變化：隨造模時間延長，肝組織脂聯(lián)素和AMPK的mRNA、蛋白表達逐漸減少，Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達逐漸增加，與正常對照組比較P＜0.05或P＜0.01。肝組織脂聯(lián)素和AMPKmRNA表達呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.81，P值＜0.01；二者均與Ⅰ型膠原mRNA表達呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別

15、為-0.88和-0.87，P值均＜0.01。以p-AMPK/AMPK表示其活性，則AMPK活性降低。肝組織脂聯(lián)素蛋白表達和AMPK活性呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.90，P值＜0.01；二者均與Ⅰ型膠原蛋白表達呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.91和-0.94，P值均＜0.01。
　　 2、脂聯(lián)素抑制肝星狀細胞活化的分子機制
　　 2.1 TGF-β1誘導靜止型LX-2細胞表達α-SMA、Ⅰ型膠原，減弱AMPK活性，減少eNOS表

16、達，增加iNOS表達：經(jīng)ADM處理3天后，LX-2細胞僅表達少量α-SMA和Ⅰ型膠原，基本分化為靜止表型。用TGF-β1處理靜止型LX-2細胞，結(jié)果LX-2細胞活化并合成大量α-SMA和Ⅰ型膠原，α-SMAmRNA和蛋白表達均增加（0.55±0.05vs.0.12±0.02：0.58±0.07vs.0.13±0.03，P值均＜0.05）、Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達均增加(0.46±0.10vs.0.09±0.02;0.43±0.07vs

17、.0.08±0.03，P值均＜0.05);p-AMPK表達減少，AMPK活性減弱（用p-AMPK/AMPK表示：0.24±0.04vs.0.43±0.07，P＜0.05），eNOSmRNA和蛋白表達減少（0.30±0.10vs.0.44±0.08;0.30±0.09vs.0.46±0.07，P值均＜0.05），iNOSmRNA和蛋白表達增加（0.53±0.07vs.0.37±0.04;0.55±0.07vs.0.39±0.05，P值均＜

18、0.05）。
　　 2.2脂聯(lián)素抑制靜止型LX-2細胞活化，增強LX-2細胞中AMPK的活性，增加eNOS表達，減少iNOS表達：用脂聯(lián)素處理靜止型LX-2細胞，結(jié)果α-SMA和Ⅰ型膠原表達與對照組相比無統(tǒng)計學差異，AMPK活性增強（0.53工0.06vs.0.43±0.07，P＜0.05），eNOSmRNA和蛋白的表達增加(0.56±0.10vs.0.44±0.08;0.55±0.05vs.0.46±0.07,P值均＜0.05

19、)，iNOSmRNA和蛋白的表達減少（0.30±0.02vs.0.37±0.04;0.32±0.03vs.0.39±0.05，P值均＜0.05）。
　　 2.3脂聯(lián)素抑制由TGF-β1導致的α-SMA、Ⅰ型膠原高表達，增強AMPK活性，上調(diào)eNOS表達，下調(diào)iNOS表達：用脂聯(lián)素干預經(jīng)TGF-β1預處理的LX-2細胞，與TGF-β1組相比，α-SMAmRNA和蛋白表達下降（0.32±0.08vs.0.55±0.05;0.32±0

20、.04vs.0.58±0.07,P值均＜0.05）、Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達下降（0.29±0.05vs.0.46±0.10;0.32±0.04vs.0.43±0.07，P值均＜0.05），AMPK活性增強（0.43±0.07vs.0.24±0.04，P＜0.05），eNOSmRNA和蛋白的表達增加（0.43±0.08vs.0.30±0.10;0.42±0.07vs.0.30±0.09，P值均＜0.05），iNOSmRNA和蛋白的表達

21、減少（0.44±0.05vs.0.53±0.07;0.46±0.07vs.0.55±0.07，P值均＜0.05）。
　　 2.4脂聯(lián)素上調(diào)由L-NAME導致的eNOS低表達，抑制α-SMA和Ⅰ型膠原表達：用L-NAME處理靜止型LX-2細胞，并以TGF-β1作為陽性對照，結(jié)果二者均能導致LX-2細胞高表達α-SMA和Ⅰ型膠原、低表達eNOS。與對照組相比，L-NAME組的α-SMAmRNA和蛋白表達均增加（0.41±0.04vs

22、.0.12±0.02;0.40±0.07vs.0.13±0.03,P＜0.05），Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達均增加（0.38±0.06vs.0.09±0.02;0.38±0.05vs.0.08±0.03，P＜0.05），eNOSmRNA和蛋白表達均減少（0.19±0.05vs.0.44±0.08;0.17±0.04vs.0.46±0.07，P值均＜0.05），iNOSmRNA和蛋白表達亦減少（0.22±0.05vs.0.37±0.04;

23、0.25±0.04vs.0.39±0.05，P值均＜0.05），AMPK活性無差異。脂聯(lián)素能上調(diào)由L-NAME導致的eNOS低表達，與L-NAME組比較，脂聯(lián)素+L-NAME組eNOS蛋白表達增加（0.31±0.05vs.0.17±0.04，P＜0.05），eNOSmRNA表達也增加，但無統(tǒng)計學意義。脂聯(lián)素對L-NAME導致的iNOS低表達無影響，維持其低水平。
　　 3、辛伐他汀對非酒精性脂肪性肝纖維化的治療作用及其機制

24、>　　 3.1模型大鼠血清生化指標和脂聯(lián)素的變化：隨著造模時間延長，模型組大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平逐漸升高，脂聯(lián)素水平逐漸降低，與對照組相比P＜0.05或P＜0.01。與模型24周組相比，辛伐他汀治療組大鼠血清ALT、AST、TC、TG降低(P＜0.05或P＜0.01)，脂聯(lián)素水平雖有所升高，但無統(tǒng)計學意義。
　　 3.2肝組織病理學改變：隨造模時間延長，肝細胞脂肪變性、小葉內(nèi)炎癥及纖維化程度逐漸加重。造模第24

25、周末，模型組大鼠肝組織均出現(xiàn)明顯竇周纖維化，部分可見中央靜脈周圍和匯管區(qū)纖維化。辛伐他汀干預組大鼠肝組織脂肪變性、炎癥及纖維程度均較模型24周組減輕。
　　 3.3大鼠肝組織脂聯(lián)素、eNOS、Ⅰ型膠原mRNA和蛋白的表達變化：隨造模時間延長，模型組大鼠肝組織脂聯(lián)素、eNOSmRNA和蛋白表達逐漸減少，Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達逐漸增加，與正常對照組比較P＜0.05或P＜0.01。與模型24周組相比，辛伐他汀組大鼠肝組織脂聯(lián)素mR

26、NA和蛋白的表達均增加(0.34±0.04vs.0.27±0.05;0.36±0.05vs.0.24±0.06，P＜0.05)，eNOSmRNA和蛋白的表達均增加(0.30±0.02vs.0.24±0.01;0.45±0.04vs.0.22±0.02，P＜0.05)，Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達均減少（0.14±0.01vs.0.25±0.01;0.54±0.02vs.0.89±0.03，P＜0.05）。模型組大鼠肝組織中eNOSmRNA

27、和蛋白表達與Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達均呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.91、-0.92、-0.92和-0.89，P值均＜0.01。
　　 3.4辛伐他汀抑制靜止型LX-2細胞活化，上調(diào)eNOS表達：用辛伐他汀處理靜止型LX-2細胞，與對照組相比，α-SMA和Ⅰ型膠原表達均無統(tǒng)計學差異，eNOSmRNA和蛋白的表達均增加(0.52±0.03vs.0.41±0.02：0.52±0.02vs.0.45±0.03,P＜0.05)。

28、>　　 3.5辛伐他汀抑制由L-NAME導致的eNOS低表達，抑制α-SMA和Ⅰ型膠原表達：用辛伐他汀干預經(jīng)L-NAME預處理的LX-2細胞，與L-NAME組相比，α-SMAmRNA和蛋白表達均下降（0.28±0.02vs.0.34±0.02;0.26±0.02vs.0.36±0.02，P＜0.05），Ⅰ型膠原mRNA和蛋白表達均下降（0.30±0.02vs．0.40±0.03;0.26±0.02vs.0.31±0.02，P＜0.05

29、），eNOSmRNA和蛋白的表達均增加(0.25±0.02vs.0.12±0.02;0.23±0.03vs.0.12±0.02,P＜0.05)。
　　 3.6辛伐他汀上調(diào)靜止型HSC中脂聯(lián)素的表達：用辛伐他汀處理靜止型LX-2細胞，與對照組相比，脂聯(lián)素mRNA和蛋白表達增加，且呈時間和劑量依賴式遞增。
　　 結(jié)論：
　　 1、應(yīng)用高脂飲食可以成功復制非酒精性脂肪性肝纖維化大鼠模型。
　　 2、脂聯(lián)素與AM