兩種視網(wǎng)膜下新生血管小鼠模型基因表達(dá)譜的RNA-Seq研究.pdf

1、目的：Vldlr基因敲除小鼠和激光誘導(dǎo)脈絡(luò)膜新生血管的小鼠模型是研究年齡相關(guān)性黃斑變性的重要工具，但引起它們視網(wǎng)膜下新生血管（SNV）早期分子水平改變的機(jī)制尚未完全明確。本文基于RNA測(cè)序（RNA-Seq）技術(shù)，對(duì)這兩種SNV小鼠模型視網(wǎng)膜進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析和驗(yàn)證。
　　方法：分別取16天齡Vldlr-/-小鼠和野生型C57小鼠視網(wǎng)膜組織各3只，使用TRIzol和酚氯法提取視網(wǎng)膜總RNA。另外，使用Nd:YAG激光構(gòu)建

2、激光誘導(dǎo)CNV小鼠模型后，用同樣的方法提取3只激光誘導(dǎo)CNV小鼠視網(wǎng)膜總RNA。在Illumina HiSeq2000平臺(tái)上對(duì)6個(gè)樣本所建的cDNA文庫(kù)按每個(gè)樣本200萬(wàn)條100bp行末端配對(duì)法（pair-end）進(jìn)行測(cè)序，所得讀數(shù)用Bowtie2.0.7版本比對(duì)到小鼠的全基因組序列（UCSC版本mm10）上，剪接接頭用TopHat2.0.8版本進(jìn)行識(shí)別。RNA-Seq數(shù)據(jù)的定量和基因差異表達(dá)分析R語(yǔ)言包GenomeRanges、lib

3、Samtools和EdgeR完成。PANTHER、DAVID、Cytoscape、STRING、BINGO、GeneMania等生物信息學(xué)軟件以及EXCEL軟件綜合分析，系統(tǒng)評(píng)價(jià)了SNV差異表達(dá)基因的功能分類(lèi)。利用qPCR對(duì)7個(gè)與SNV相關(guān)的基因進(jìn)行mRNA表達(dá)水平的驗(yàn)證。
　　結(jié)果：選取假發(fā)現(xiàn)率FDR<0.05和編碼蛋白基因?yàn)檫^(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)，與對(duì)照組相比，Vldlr-/-小鼠視網(wǎng)膜共檢測(cè)到1204個(gè)差異表達(dá)的基因中，763（63％）個(gè)

4、基因表達(dá)上調(diào)，而441（37%）個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)這些因子主要參與眼的發(fā)育、翻譯過(guò)程、黑色素合成和氧化磷酸化等生物學(xué)過(guò)程。激光誘導(dǎo)CNV小鼠視網(wǎng)膜共檢測(cè)到1399個(gè)差異表達(dá)的基因中，1092（78.1％）個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，而307（21.9％）個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，這些基因主要參與趨化因子或細(xì)胞因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、視覺(jué)感知等生物學(xué)過(guò)程。選擇符合FDR＜0.05，Log2FC≥2的基因作為進(jìn)一步篩選標(biāo)準(zhǔn)，兩組數(shù)據(jù)中共存的

5、差異表達(dá)基因27個(gè)，運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)分子功能（MF）、生物學(xué)過(guò)程（BP）和信號(hào)通路（pathway）進(jìn)行分析顯示它們主要參與血管發(fā)育、新生血管形成、蛋白質(zhì)結(jié)合等生物學(xué)過(guò)程。qPCR結(jié)果顯示RNA倍數(shù)的變化與RNA-Seq結(jié)果相比，兩者變化方向一致。
　　結(jié)論：Vldlr基因敲除小鼠和激光誘導(dǎo)脈絡(luò)膜新生血管小鼠均是研究視網(wǎng)膜下新生血管形成良好動(dòng)物模型，我們采用RNA-Seq技術(shù)對(duì)這兩種SNV小鼠模型視網(wǎng)膜進(jìn)行測(cè)序，揭示了其視網(wǎng)膜