牛分枝桿菌MPB83基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達.pdf

1、牛結核病(bovine tuberculosis)是由牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)引起的一種以呼吸道病變?yōu)橹鞯穆赃M行性傳染病。MPB83蛋白是牛分枝桿菌培養(yǎng)早期分泌到上清中的一種分泌性脂蛋白，在牛分枝桿菌中高水平表達，具有良好的免疫原性和免疫保護性。為觀察重組MPB83蛋白的免疫活性，揭示該蛋白在牛結核病的診斷和防治中的作用，本研究利用PCR技術擴增了牛分枝桿菌MPB83基因，利用分子克隆技術實現(xiàn)了MPB83蛋

2、白在大腸桿菌中的表達，并對重組蛋白進行了純化和免疫印跡分析，為進一步研究其在牛結核病診斷中的應用提供了實驗依據(jù)。 首先，本實驗參照Gerd3ank中發(fā)表的牛分枝桿菌AF2122/97株MPB83基因序列，設計合成一對帶酶切位點的引物，對MPB83基因進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，呈現(xiàn)一條約600bp的特異性條帶，將其回收后克隆到pGEM-T Easy載體中，構建出克隆載體pGEM-MPB83，經(jīng)測序鑒定后，將目的基因

3、亞克隆至表達載體pET-30a中，得到陽性重組表達質粒pET30a-MPB83。 將重組質粒pET30a-MPB83轉化表達宿主菌BL21(DE3)，經(jīng)濃度為1mmol/L的IPTG誘導表達。SDS-PAGE分析表明，該融合蛋白以包涵體的形式表達，其分子量約為26kDa，蛋白表達量約占菌體總蛋白的20％，從而實現(xiàn)了MPB83重組蛋白在大腸桿菌中的高效表達。Western-Blot檢測表明，表達的融合蛋白可被牛分枝桿菌陽性血清所識