GRIM-19與E6和E6AP的蛋白相互作用及作用位點(diǎn)的研究.pdf

1、研究背景:
　　子宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤中最常見的惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅著女性的健康和生命。全世界每年大約有50萬新發(fā)子宮頸癌病例,約23萬女性死于子宮頸癌,其中大部分(80％左右)發(fā)生在發(fā)展中國家。其中發(fā)病率最高的是南非,其次是亞洲。我國每年新發(fā)病例約13萬例,占全世界的近1/4。子宮頸癌的病因迄今未完全明確。分子生物學(xué)研究表明90%以上的子宮頸癌伴有高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)感染,主要是16、18亞型。高危型HP

2、V持續(xù)感染在子宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用,70%以上的子宮頸癌組織中存在HR-HPV基因組的整合。
　　目前的研究證實(shí),高危型HPV16和18型的早期基因E6、E7編碼的早期蛋白E6、E7在宮頸上皮細(xì)胞惡化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。E6、E7蛋白分別于P53和Rb結(jié)合,使P53和Rb降解,最終導(dǎo)致子宮頸癌的發(fā)生。E6蛋白的致癌作用主要表現(xiàn)在招募E6AP(E6-associated protein)形成復(fù)合體后與P53核心區(qū)結(jié)

3、合,促進(jìn)P53通過泛素蛋白酶體降解途徑降解。E6AP是泛素連接酶(ubiquitin-ligase enzyme,E3)的HECT結(jié)構(gòu)域家族成員。HPV E6蛋白與E6AP結(jié)合后將活化的泛素轉(zhuǎn)移到P53蛋白上,最終P53蛋白在26S蛋白酶體的作用下沿泛素化降解途徑降解。在子宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中,E6對(duì)P53的抑制和降解作用起著關(guān)鍵作用。
　　GRIMs(genes associated with retinoid-IFN-indu

4、cedmortality)是近年來發(fā)現(xiàn)的一群參與干擾素(interferon,IFN)和維甲酸(retinoic acid,RA)合并誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡基因,是Kalvakolanu用反義 RNA敲除技術(shù)在乳腺癌細(xì)胞中篩選鑒定并首先報(bào)道的凋亡蛋白。GRIM-19屬GRIMs家族成員,定位于19 p13.2,是參與細(xì)胞線粒體的呼吸作用和調(diào)控細(xì)胞凋亡的新基因。GRIM-19主要定位在線粒體,細(xì)胞核也有少量表達(dá),在人體多種正常組織中均有其表達(dá)。研

5、究發(fā)現(xiàn)GRIM-19的表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡,其表達(dá)降低或位點(diǎn)突變可以導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化。許多腫瘤中,如甲狀腺腫瘤、口腔癌、腎癌、結(jié)直腸癌等中均發(fā)現(xiàn)GRIM-19表達(dá)的降低。但GRIM-19在子宮頸癌細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展中所發(fā)揮的具體作用尚不明晰。
　　本課題組前期試驗(yàn)已證實(shí)在子宮頸癌細(xì)胞株HeLa、SiHa和CaSki細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)GRIM-19可以上調(diào)p53及其下游基因p21、PUMA的表達(dá),而HPV陰性的卵巢癌細(xì)胞株H089

6、10細(xì)胞中卻并未發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象。GRIM-19具有誘導(dǎo)子宮頸癌細(xì)胞中 P53蛋白積聚的重要作用且積聚的P53蛋白具有抑制子宮頸癌細(xì)胞增殖的功能。而且證實(shí)GRIM-19誘導(dǎo)子宮頸癌細(xì)胞中P53蛋白的積聚作用既不是直接作用也不是通過抑制STAT3而間接促進(jìn)P53基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯,而是通過抑制子宮頸癌細(xì)胞中P53蛋白的降解,延長其半衰期來達(dá)到誘導(dǎo) P53蛋白積聚的作用。子宮頸癌細(xì)胞中P53蛋白的降解是通過E6和E6AP的共同作用來實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)組

7、前期以HPV18E6為研究對(duì)象,進(jìn)一步研究了子宮頸癌細(xì)胞中GRIM-19與HPV18E6的相互作用,結(jié)果顯示:GRIM-19與18E6具有蛋白結(jié)合作用,而與p53沒有蛋白結(jié)合作用;GRIM-19誘導(dǎo)HR-HPV感染的子宮頸癌細(xì)胞中p53蛋白積聚的作用機(jī)制是通過與E6蛋白結(jié)合,阻礙E6介導(dǎo)的p53泛素化降解途徑;E6AP具有競爭18E6結(jié)合GRIM-19的作用。本實(shí)驗(yàn)將以HPV16E6、HPV18E6為研究對(duì)象,進(jìn)一步探討子宮頸癌細(xì)胞中G

8、RIM-19與HPV16E6、HPV18E6的相互作用及其作用位點(diǎn)。
　　目的:
　　研究子宮頸癌細(xì)胞中GRIM-19與HPV16E6、HPV18E6的相互作用及其作用位點(diǎn)的研究,為子宮頸癌的生物治療提供新的理論依據(jù)和治療線索。
　　方法:
　　(1)構(gòu)建GRIM-19,HPV16E6原核表達(dá)載體:pGST-G19①[pGEX-4T-3-GRIM-19(1-35)]、pGST-G19②[pGEX-4T-3-GRI

9、M-19(36-70)]、pGST-G19③[pGEX-4T-3-GRIM-19(71-144)]、pET-flag-16E6(pET-22b-3×flag-16E6),16E6真核表達(dá)質(zhì)粒:p3×Flag-16E6(p3×Flag-CMV-Myc-24-16E6);(2)采用免疫共沉淀方法(CO-IP)檢測GRIM-19與16E6蛋白的體內(nèi)結(jié)合作用;(3)誘導(dǎo)融合蛋白在大腸桿菌中表達(dá)與純化;(4)采用GST pull down方法檢測

10、GRIM-19與16E6、18E6蛋白的體外結(jié)合作用;(5)采用GST pull down方法檢測GRIM-19與E6AP蛋白的體外結(jié)合作用。
　　結(jié)果:
　　(1)CO-IP方法檢測結(jié)果顯示在宮頸癌細(xì)胞株SiHa細(xì)胞中GRIM-19與16E6在體內(nèi)具有蛋白結(jié)合作用(2)GST pull down方法檢測結(jié)果顯示GRIM-19①與HPV16E6在體外具有蛋白結(jié)合作用;(3)GST pull down方法檢測結(jié)果顯示GRIM-

11、19①與HPV18E6在體外具有蛋白結(jié)合作用;(4)GST pull down方法檢測結(jié)果顯示GRIM-19與E6AP①在體外具沒有蛋白結(jié)合作用;(5)GST pull down方法檢測結(jié)果顯示GRIM-19與E6AP②在體外具沒有蛋白結(jié)合作用;(6)GST pull down方法檢測結(jié)果顯示GRIM-19與E6AP③在體外具有蛋白結(jié)合作用;(7)GST pull down方法檢測結(jié)果顯示GRIM-19①與E6AP③在體外具有蛋白結(jié)合作