RNAi技術(shù)抑制同源異型盒基因HLX1表達(dá)對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和侵襲的影響.pdf

1、研究背景及目的: 同源異型盒基因是一類重要的調(diào)控細(xì)胞分化和形態(tài)發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子基因家族，其中HLX1基因與胚胎來(lái)源細(xì)胞和造血系細(xì)胞的增殖、分化行為密切相關(guān)。近年來(lái)研究陸續(xù)表明，HLX1基因?qū)τ谡ＬケP(pán)形成起重要作用；HLX1蛋白在細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞系HTR-8/SVneo、SGHPL-4、JEG-3、JAR和BeWo的細(xì)胞中均有表達(dá)；病理妊娠如特發(fā)性胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限（FGR）的胎盤(pán)中HLX1基因表達(dá)水平明顯降低。本研究旨在運(yùn)用

2、RNAi技術(shù)抑制滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR-8/SVneo中HLX1基因的表達(dá)，探討其對(duì)體外滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和侵襲行為的影響，為HLX1基因異常表達(dá)可能參與FGR等病理妊娠的發(fā)病提供基礎(chǔ)理論支持。 方法: 1．復(fù)蘇、培養(yǎng)人早孕期胎盤(pán)絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR-8/SVneo至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期備用。 2．應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、Western Blot方法檢測(cè)HTR-8/SVneo細(xì)胞中HLX1 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)

3、。 3．依據(jù)GeneBank中HLX1 cDNA序列號(hào)NM_021958，設(shè)計(jì)并化學(xué)合成siRNA序列，分別為：4條特異性HLX1 siRNA的預(yù)混試劑；1條非特異性陰性對(duì)照siRNA試劑，DY-547熒光標(biāo)記。 4．HTR-8/SVneo細(xì)胞常規(guī)體外培養(yǎng)，設(shè)為三組：實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染HLX1 siRNAs）、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA）以及空白對(duì)照組（除不含siRNA，余試劑與另兩組均相同），分別進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。

4、 5．將DY-547標(biāo)記的陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染入HTR-8/SVneo細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）測(cè)定轉(zhuǎn)染效率，篩選出轉(zhuǎn)染效率最佳優(yōu)化條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 6．應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和Western Blot方法分別檢測(cè)三組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后HLX1基因mRNA和蛋白的表達(dá)，評(píng)價(jià)干擾效果。 7．細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將三組HTR-8/SVneo細(xì)胞以相同數(shù)量接種，過(guò)夜培養(yǎng)后進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽（MTT）

5、比色法每隔24測(cè)定吸光度值后繪制生長(zhǎng)曲線。 8．細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用Transwell小室檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組HTR-8/SVneo細(xì)胞穿透人工重組基底膜的能力。三組HTR-8/SVneo細(xì)胞以相同數(shù)量接種，過(guò)夜培養(yǎng)后進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，24小時(shí)后，用無(wú)血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞并以相同數(shù)量接種于包被有Matrigel基質(zhì)膠的小室上室，下室加入20％FCS的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24h，40倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。 9．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用

6、SPSS 11．0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示定量資料數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），認(rèn)為P<0．05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1．HLX1 mRNA和蛋白在HTR-8/SVneo細(xì)胞中均呈陽(yáng)性表達(dá)。 2．siRNA轉(zhuǎn)染效率優(yōu)化后可達(dá)（86．3±2．6）％，以相同條件進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 3．與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染HLX1 siRNAs后特異且有效地抑制了HT

7、R-8/SVneo細(xì)胞中HLX1基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)染48h后HLX1 mRNA的表達(dá)降低（77．0±1．2）％（P<0．01），轉(zhuǎn)染72h后HLX1蛋白的抑制率為（82．6±1．2）％（P<0．01）。 4．與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染HLX1 siRNAs后HTR-8/SVneo細(xì)胞的增殖活性下降，轉(zhuǎn)染72h后增殖抑制效應(yīng)最為顯著，抑制率為（58．1±4．4）％（P<0．01）。 5．與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相