RNAi抑制S100A4基因表達(dá)及其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響.pdf

1、前言：
　　 骨肉瘤是臨床常見的成骨性惡性腫瘤,約占所有骨腫瘤的20％。其惡性程度高,易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差。隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)水平的提高,尤其是腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展,骨肉瘤的發(fā)生機(jī)制在分子水平上有了新的認(rèn)識(shí)。近年來的研究表明,S100A4基因和蛋白的異常表達(dá)與惡性腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān),特別在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。有關(guān)S100A4蛋白與多種腫瘤生物學(xué)特性的研究已相繼開展。
　　 S100A4蛋白是

2、1989年由Sbralidze從高轉(zhuǎn)移性小鼠乳癌細(xì)胞中克隆出來的一種轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。1992年克隆了人類S100A4基因。該基因位于染色體1q21,基因全長2837bp,編碼101個(gè)氨基酸的蛋白。該區(qū)易發(fā)生各種染色體的缺失、易位、重疊等改變,提示S100A4蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。S100A4蛋白與Ca離子結(jié)合后可能導(dǎo)致S100A4蛋白構(gòu)型改變,在表面暴露新的結(jié)合位點(diǎn),從而可與一系列靶蛋白結(jié)合。S100A4蛋白通過參與降低腫瘤細(xì)胞間

3、粘附力、增加腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力、重塑細(xì)胞外基質(zhì)、抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞異常增生、促進(jìn)新生血管生成等各個(gè)階段,進(jìn)而促進(jìn)了惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。對(duì)S100A4蛋白結(jié)構(gòu)功能以及編碼基因的研究有待于進(jìn)一步深入。S100A4蛋白不僅有希望成為惡性腫瘤的診斷指標(biāo)和評(píng)估患者預(yù)后的腫瘤標(biāo)記物;而且有希望通過下調(diào)S100A4基因表達(dá)使其成為針對(duì)惡性腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的

4、研究生物體基因表達(dá)、調(diào)控與功能的一項(xiàng)新技術(shù),它利用了由小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)引起的生物細(xì)胞內(nèi)同源基因的特異性沉默現(xiàn)象,其本質(zhì)是siRNA與對(duì)應(yīng)的mRNA特異結(jié)合、降解,從而阻止mRNA的翻譯。RNAi是生物進(jìn)化的結(jié)果,是生物體對(duì)病毒基因等外源核酸侵入的一種保護(hù)性反應(yīng)。它普遍存在于各種生物,具有抗病毒、穩(wěn)定轉(zhuǎn)座子及監(jiān)控異常表達(dá)mRNA的生物學(xué)功能。RNA干擾現(xiàn)象不僅能提供一種經(jīng)濟(jì)、快捷、高效

5、的抑制基因表達(dá)的技術(shù)手段,而且有可能在基因功能測(cè)定,基因治療等方面開辟一條新思路。
　　 本研究首先驗(yàn)證S100A4基因在不同的人骨肉瘤細(xì)胞系和骨肉瘤組織中的表達(dá)情況,再應(yīng)用RNA干擾技術(shù),抑制人骨肉瘤MG-63細(xì)胞S100A4基因的表達(dá),并觀察其對(duì)細(xì)胞增殖及體外侵襲能力的影響,初步探討其作用機(jī)制。本文共分三個(gè)部分,第一部分:S100A4在骨肉瘤細(xì)胞系中基因水平的表達(dá)研究;第二部分:S100A4和CD44V6在骨肉瘤組織中的表達(dá)

6、及相關(guān)性研究;第三部分:RNAi抑制S100A4基因表達(dá)及其對(duì)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞生物學(xué)特性和侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響并初步探討其作用機(jī)制。
　　 目的：
　　 第一部分:檢測(cè)在人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63及U-20S中S100A4基因的表達(dá)情況;第二部分:檢測(cè)骨肉瘤組織中S100A4和CD44V6的表達(dá)情況,并分析其臨床意義;第三部分:RNAi技術(shù)抑制人骨肉瘤MG-63細(xì)胞S100A4基因的表達(dá),并觀察其對(duì)細(xì)胞增殖及體外侵襲

7、能力的影響,并初步探討其作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 第二部分:人骨肉瘤細(xì)胞MG-63及U-20S購自中科院上海細(xì)胞研究所,應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)S100A4基因在入骨肉瘤細(xì)胞MG-63及U-20S中的表達(dá);第二部分:收集中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2004-2008年收治的骨肉瘤病例33例,2008年收治的骨軟骨瘤病例13例。用SP法檢測(cè)骨肉瘤S100A4、CD44V6蛋白表達(dá),探討骨肉瘤組織中S100A

8、4和CD44V6表達(dá)的關(guān)系及與臨床病理因素的聯(lián)系;第三部分:依據(jù)Ambion公司提供的設(shè)計(jì)原則,根據(jù)S100A4基因在GenBank中序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的siRNA,合成針對(duì)S100A4的siRNA載體。熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況,應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后S100A4基因表達(dá)的變化,應(yīng)用Western-Blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后S100A4蛋白表達(dá)的變化。篩選出轉(zhuǎn)染效率比較高的特異性siRNA作為后續(xù)試驗(yàn)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組,應(yīng)

9、用MTT法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖率的變化,應(yīng)用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的變化,并應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后CD44和MMP2基因表達(dá)的變化,初步探討RNA干擾抑制人骨肉瘤細(xì)胞S100A4基因的表達(dá)對(duì)細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力影響的可能機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分:Real-time PCR反應(yīng)結(jié)果顯示,人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63及U-20S中均有S100A4基因表達(dá),并且

10、它們的表達(dá)程度接近。
　　 第二部分:S100A4蛋白在骨肉瘤組織中表達(dá)的陽性率是69.7％,陽性表達(dá)的位置在骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞漿,對(duì)照組未見S100A4蛋白表達(dá)。CD44V6蛋白陽性表達(dá)的位置在骨肉瘤和骨軟骨瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和近膜的胞漿,在骨肉瘤組織中表達(dá)的陽性率是60.6％,在骨軟骨瘤中的陽性率僅為7.7％。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的骨肉瘤組織中S100A4和CD44V6的表達(dá)具有相關(guān)性(r=0.413,P＜0.05),S100A4和CD44

11、V6在骨肉瘤組織中的表達(dá)水平與患者的性別、年齡、腫瘤原發(fā)部位、腫瘤細(xì)胞病理分型進(jìn)行比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);第三部分:倒置顯微鏡下轉(zhuǎn)染非特異性siRNA組(C2組)、轉(zhuǎn)染特異性siRNA組(S1、S2、S3組)可見綠色熒光,表達(dá)部位在細(xì)胞漿。各特異性siRNA轉(zhuǎn)染組S100A4 mRNA表達(dá)水平有不同程度的下調(diào),以siRNA3組最為顯著,Western-Blot檢測(cè)S100A4蛋白表達(dá)得到相似結(jié)論。MTT法和平板克隆形成實(shí)

12、驗(yàn)均顯示特異性siRNA轉(zhuǎn)染組能夠抑制細(xì)胞的增殖,與對(duì)照組,非特異性組比較有顯著性差異(P＜0.05)。Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示:RNA干擾S100A4基因表達(dá)后腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)侵襲能力明顯下降,穿過人工基底膜的細(xì)胞數(shù)量明顯減少,與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法比較S100A4特異性siRNA轉(zhuǎn)染前后CD44和MMP2表達(dá)的變化,抑制S100A4基因的表達(dá)同樣影響到CD44和MMP2的

13、表達(dá),CD44的表達(dá)下降到42.33％±0.0322,MMP2的表達(dá)下降到71.67％±0.0551,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 第一部分:在人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63及U-2OS中,均有S100A4基因的表達(dá),并且它們的表達(dá)程度接近。
　　 第二部分:S100A4在本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的骨肉瘤組織中有較高水平的表達(dá),并且與CD44V6在骨肉瘤組織中的表達(dá)有相關(guān)性;第三部分:體外合成的S100A4

14、特異性siRNA載體能夠有效抑制骨肉瘤細(xì)胞系MG-63中S100A4的表達(dá),抑制細(xì)胞的增殖,抑制細(xì)胞的體外侵襲能力,S100A4基因的表達(dá)減弱可以抑制CD44和MMP2基因的表達(dá)而降低骨肉瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。
　　 RNA干擾技術(shù)為骨肉瘤的治療提供了一種新的思路,S100A4基因與骨肉瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān),應(yīng)用此技術(shù)抑制S100A4基因的表達(dá)可能成為骨肉瘤手術(shù)、化療、放療等傳統(tǒng)治療的輔助手段,本研究為應(yīng)用RNAi進(jìn)行腫瘤的