RNAi抑制S100A4基因表達及其對骨肉瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響.pdf

1、前言：
　　 骨肉瘤是臨床常見的成骨性惡性腫瘤,約占所有骨腫瘤的20％。其惡性程度高,易復發(fā)和轉(zhuǎn)移,預后較差。隨著分子生物學理論和技術(shù)水平的提高,尤其是腫瘤分子生物學的發(fā)展,骨肉瘤的發(fā)生機制在分子水平上有了新的認識。近年來的研究表明,S100A4基因和蛋白的異常表達與惡性腫瘤的生物學行為密切相關,特別在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。有關S100A4蛋白與多種腫瘤生物學特性的研究已相繼開展。
　　 S100A4蛋白是

2、1989年由Sbralidze從高轉(zhuǎn)移性小鼠乳癌細胞中克隆出來的一種轉(zhuǎn)移相關基因。1992年克隆了人類S100A4基因。該基因位于染色體1q21,基因全長2837bp,編碼101個氨基酸的蛋白。該區(qū)易發(fā)生各種染色體的缺失、易位、重疊等改變,提示S100A4蛋白與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切。S100A4蛋白與Ca離子結(jié)合后可能導致S100A4蛋白構(gòu)型改變,在表面暴露新的結(jié)合位點,從而可與一系列靶蛋白結(jié)合。S100A4蛋白通過參與降低腫瘤細胞間

3、粘附力、增加腫瘤細胞的運動能力、重塑細胞外基質(zhì)、抑制細胞凋亡,促進細胞異常增生、促進新生血管生成等各個階段,進而促進了惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。對S100A4蛋白結(jié)構(gòu)功能以及編碼基因的研究有待于進一步深入。S100A4蛋白不僅有希望成為惡性腫瘤的診斷指標和評估患者預后的腫瘤標記物;而且有希望通過下調(diào)S100A4基因表達使其成為針對惡性腫瘤基因治療的新靶點。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)是近年來發(fā)現(xiàn)的

4、研究生物體基因表達、調(diào)控與功能的一項新技術(shù),它利用了由小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)引起的生物細胞內(nèi)同源基因的特異性沉默現(xiàn)象,其本質(zhì)是siRNA與對應的mRNA特異結(jié)合、降解,從而阻止mRNA的翻譯。RNAi是生物進化的結(jié)果,是生物體對病毒基因等外源核酸侵入的一種保護性反應。它普遍存在于各種生物,具有抗病毒、穩(wěn)定轉(zhuǎn)座子及監(jiān)控異常表達mRNA的生物學功能。RNA干擾現(xiàn)象不僅能提供一種經(jīng)濟、快捷、高效

5、的抑制基因表達的技術(shù)手段,而且有可能在基因功能測定,基因治療等方面開辟一條新思路。
　　 本研究首先驗證S100A4基因在不同的人骨肉瘤細胞系和骨肉瘤組織中的表達情況,再應用RNA干擾技術(shù),抑制人骨肉瘤MG-63細胞S100A4基因的表達,并觀察其對細胞增殖及體外侵襲能力的影響,初步探討其作用機制。本文共分三個部分,第一部分:S100A4在骨肉瘤細胞系中基因水平的表達研究;第二部分:S100A4和CD44V6在骨肉瘤組織中的表達

6、及相關性研究;第三部分:RNAi抑制S100A4基因表達及其對人骨肉瘤MG-63細胞生物學特性和侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響并初步探討其作用機制。
　　 目的：
　　 第一部分:檢測在人骨肉瘤細胞系MG-63及U-20S中S100A4基因的表達情況;第二部分:檢測骨肉瘤組織中S100A4和CD44V6的表達情況,并分析其臨床意義;第三部分:RNAi技術(shù)抑制人骨肉瘤MG-63細胞S100A4基因的表達,并觀察其對細胞增殖及體外侵襲

7、能力的影響,并初步探討其作用機制。
　　 方法：
　　 第二部分:人骨肉瘤細胞MG-63及U-20S購自中科院上海細胞研究所,應用Real-time PCR方法檢測S100A4基因在入骨肉瘤細胞MG-63及U-20S中的表達;第二部分:收集中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院2004-2008年收治的骨肉瘤病例33例,2008年收治的骨軟骨瘤病例13例。用SP法檢測骨肉瘤S100A4、CD44V6蛋白表達,探討骨肉瘤組織中S100A

8、4和CD44V6表達的關系及與臨床病理因素的聯(lián)系;第三部分:依據(jù)Ambion公司提供的設計原則,根據(jù)S100A4基因在GenBank中序列設計相應的siRNA,合成針對S100A4的siRNA載體。熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況,應用Real-time PCR方法檢測轉(zhuǎn)染前后S100A4基因表達的變化,應用Western-Blot方法檢測轉(zhuǎn)染前后S100A4蛋白表達的變化。篩選出轉(zhuǎn)染效率比較高的特異性siRNA作為后續(xù)試驗的轉(zhuǎn)染實驗組,應

9、用MTT法和平板克隆形成實驗檢測細胞增殖率的變化,應用Transwell小室實驗檢測細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的變化,并應用Real-time PCR方法檢測轉(zhuǎn)染前后CD44和MMP2基因表達的變化,初步探討RNA干擾抑制人骨肉瘤細胞S100A4基因的表達對細胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力影響的可能機制。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分:Real-time PCR反應結(jié)果顯示,人骨肉瘤細胞系MG-63及U-20S中均有S100A4基因表達,并且

10、它們的表達程度接近。
　　 第二部分:S100A4蛋白在骨肉瘤組織中表達的陽性率是69.7％,陽性表達的位置在骨肉瘤細胞的細胞漿,對照組未見S100A4蛋白表達。CD44V6蛋白陽性表達的位置在骨肉瘤和骨軟骨瘤細胞的細胞膜和近膜的胞漿,在骨肉瘤組織中表達的陽性率是60.6％,在骨軟骨瘤中的陽性率僅為7.7％。本實驗檢測的骨肉瘤組織中S100A4和CD44V6的表達具有相關性(r=0.413,P＜0.05),S100A4和CD44

11、V6在骨肉瘤組織中的表達水平與患者的性別、年齡、腫瘤原發(fā)部位、腫瘤細胞病理分型進行比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);第三部分:倒置顯微鏡下轉(zhuǎn)染非特異性siRNA組(C2組)、轉(zhuǎn)染特異性siRNA組(S1、S2、S3組)可見綠色熒光,表達部位在細胞漿。各特異性siRNA轉(zhuǎn)染組S100A4 mRNA表達水平有不同程度的下調(diào),以siRNA3組最為顯著,Western-Blot檢測S100A4蛋白表達得到相似結(jié)論。MTT法和平板克隆形成實

12、驗均顯示特異性siRNA轉(zhuǎn)染組能夠抑制細胞的增殖,與對照組,非特異性組比較有顯著性差異(P＜0.05)。Transwell小室實驗顯示:RNA干擾S100A4基因表達后腫瘤細胞的運動侵襲能力明顯下降,穿過人工基底膜的細胞數(shù)量明顯減少,與空白對照組、陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。用雙標準曲線的方法比較S100A4特異性siRNA轉(zhuǎn)染前后CD44和MMP2表達的變化,抑制S100A4基因的表達同樣影響到CD44和MMP2的

13、表達,CD44的表達下降到42.33％±0.0322,MMP2的表達下降到71.67％±0.0551,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 第一部分:在人骨肉瘤細胞系MG-63及U-2OS中,均有S100A4基因的表達,并且它們的表達程度接近。
　　 第二部分:S100A4在本實驗檢測的骨肉瘤組織中有較高水平的表達,并且與CD44V6在骨肉瘤組織中的表達有相關性;第三部分:體外合成的S100A4

14、特異性siRNA載體能夠有效抑制骨肉瘤細胞系MG-63中S100A4的表達,抑制細胞的增殖,抑制細胞的體外侵襲能力,S100A4基因的表達減弱可以抑制CD44和MMP2基因的表達而降低骨肉瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。
　　 RNA干擾技術(shù)為骨肉瘤的治療提供了一種新的思路,S100A4基因與骨肉瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關,應用此技術(shù)抑制S100A4基因的表達可能成為骨肉瘤手術(shù)、化療、放療等傳統(tǒng)治療的輔助手段,本研究為應用RNAi進行腫瘤的