TGF-β1介導(dǎo)的Smad3與p38MAPK在絨癌JEG-3細(xì)胞中的串話作用.pdf

1、絨毛膜癌是一種高度惡性滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤,起源于培養(yǎng)滋養(yǎng)層,可能發(fā)生于流產(chǎn)之后,或異位妊娠過(guò)程中。絨癌可通過(guò)靜脈和淋巴系統(tǒng)廣泛地轉(zhuǎn)移到其他器官或組織中。早期血液和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可導(dǎo)致患者迅速死亡。近年來(lái)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGFβ)成為腫瘤研究的熱點(diǎn)因子之一,并且它在絨癌的發(fā)生和發(fā)展中是一個(gè)關(guān)鍵因素。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)是一種具有多生物學(xué)活性功能的多肽類(lèi)細(xì)胞因子,TGFβ至少有5種異構(gòu)體

2、(TGF-β1～5),其中TGF-β1是主要存在形式,幾乎所有的細(xì)胞都能分泌 TGF-β1。它可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)形成,參與胚胎發(fā)育調(diào)節(jié)等,并且其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。TGFβ/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要由細(xì)胞膜表面的TGFβ受體及其下游胞質(zhì)內(nèi)Smad蛋白家族組成。TGFβ首先識(shí)別并與細(xì)胞膜表面的受體結(jié)合,受體復(fù)合物再激活其下游的蛋白smad2、3,使其磷酸化。被激活的smad2、3與Smad4結(jié)合,形成

3、復(fù)合物,然后進(jìn)入細(xì)胞核與核內(nèi)的各類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。近年來(lái)p38絲裂素活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移的研究中也成為熱點(diǎn)之一,并且有報(bào)道顯示TGFβ可激活p38MAPK通路,在胃癌和大鼠心肌成纖維細(xì)胞中兩個(gè)通路有交互作用,但在絨毛膜癌中 TGFβ與p38MAPK通路相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)及其機(jī)制尚不明確,因此本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用TGF-β1受體阻滯

4、劑及p38MAPK抑制因子對(duì)被TGF-β1刺激活化的絨癌JEG-3細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),對(duì)兩條通路的下游蛋白進(jìn)行檢測(cè)以揭示兩條信號(hào)通路在絨毛膜癌中交互作用的位點(diǎn)和作用機(jī)制。
　　目的:
　　探討TGF-β1介導(dǎo)的Smad3與p38MAPK在絨癌JEG-3細(xì)胞中的串話作用。
　　方法:
　　1.人絨癌細(xì)胞系JEG-3生長(zhǎng)在含10％的胎牛血清,2 mmol/L谷氨酰胺,1 mmol/L丙酮酸鈉,100 U/ml青霉素和100

5、 U/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2-3d換液一次。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至70-80%左右時(shí)用0.02%EDTA和0.25%胰酶消化液按1:3的比例進(jìn)行傳代。
　　2.JEG-3細(xì)胞以初始濃度為5×104個(gè)/mL接種于24孔板,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),次日換以無(wú)血清的RPMI-1640饑餓培養(yǎng)12h。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組,2h TGF-β1刺激組,6h TGF-β1刺激組。培養(yǎng)終止

6、前2h和6h分別給予不同組細(xì)胞5ng/ml的TGF-β1刺激,空白對(duì)照組除外。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,用免疫熒光染色法對(duì)P-Smad的表達(dá)及核轉(zhuǎn)位情況進(jìn)行檢測(cè)。
　　3.JEG-3細(xì)胞以初始濃度為5×104個(gè)/mL接種于6孔板,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),次日換以無(wú)血清的RPMI-1640饑餓培養(yǎng)12h。將細(xì)胞分組設(shè)置為6個(gè)組,分別為:空白對(duì)照組,TGF-β1刺激組,p38抑制劑(SB203580)1μM組,p38抑制劑(SB2

7、03580)3μM組,TGF-β1受體阻滯劑(LY364947)1μM組,TGF-β1受體阻滯劑(LY364947)3μM組。培養(yǎng)終止前4h分別給予各抑制劑組細(xì)胞相應(yīng)濃度的TGF-β1受體阻滯劑(LY364947)及 p38抑制劑(SB203580)。在終止培養(yǎng)前2h,給予各組細(xì)胞5ng/ml的TGF-β1刺激,空白對(duì)照組除外。用免疫印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中Smad3以及P-Smad3的蛋白表達(dá)水平。
　　4.JEG-3細(xì)胞以初始濃度

8、為5×104個(gè)/mL接種于6孔板,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),次日換以無(wú)血清的RPMI-1640饑餓培養(yǎng)12h。將細(xì)胞分組設(shè)置為6個(gè)組,分組情況如上所述。培養(yǎng)終止前4h分別給予各抑制劑組細(xì)胞相應(yīng)濃度的TGF-β1受體阻滯劑(LY364947)及p38抑制因子(SB203580)。在終止培養(yǎng)前2h,給予各組細(xì)胞5ng/ml的TGF-β1刺激,空白對(duì)照組除外。用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)smad3的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果:

9、r>　　1.在對(duì)照組中,P-Smad的表達(dá)成云霧狀主要呈現(xiàn)在胞漿中,少量表達(dá)在細(xì)胞核。TGF-β1給予2 h后,P-Smad3呈現(xiàn)胞漿胞核均表達(dá)。在TGF-β1給予6 h后,P-Smad3主要表達(dá)在胞核,即TGF-β1給予6h,P-Smad3基本完成了由胞漿到胞核的核轉(zhuǎn)位過(guò)程。
　　2.與空白對(duì)照組相比,TGF-β1刺激組的Smad3,P-Smad3蛋白表達(dá)增高(P<0.05),而TGF-β1受體阻滯劑(LY364947)1μM組

10、,TGF-β1受體阻滯劑(LY364947)3μM組中隨TGF-β1受體阻滯劑濃度的升高,Smad3,P-Smad3的蛋白表達(dá)呈濃度依賴(lài)性降低(P<0.05)。與TGF-β1刺激組相比,p38抑制劑(SB203580)1μM組,p38抑制劑(SB203580)3μM組中隨著抑制因子濃度的升高,Smad3,P-Smad3蛋白的表達(dá)亦呈濃度依賴(lài)性降低(P<0.05)。
　　3.與對(duì)照組相比,TGF-β1刺激組中的Smad3的mRNA表

11、達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與其TGF-β1刺激組相比,隨著抑制劑濃度的升高,TGF-β1受體阻滯劑組和p38抑制劑組中 Smad3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平逐漸降低(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.TGF-β1可激活Smad3,并促使磷酸化的Smad3進(jìn)行核轉(zhuǎn)位。
　　2.阻滯了P38MAPK通路,TGFβ介導(dǎo)的Smad3,P-Smad3蛋白表達(dá)均降低,且成濃度依賴(lài)性。
　　3.阻滯了P38MAPK通路,TGF-