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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:肺癌是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡率的首要原因,其中,非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占其各類型的大多數(shù),約85%。肺癌早期癥狀并不明顯,同時(shí)早期診斷標(biāo)記物及其他有效診斷手段缺乏,導(dǎo)致大多數(shù)患者在明確診斷時(shí)已處于中晚期。
上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指具有極性的上皮細(xì)胞在特定的生理或病理情況下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的生物學(xué)過程。近些年,EMT在癌癥研究中早已引起關(guān)注,并且越
2、來越多的證據(jù)表明,EMT在人類惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用。
轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor beta,TGF-β)是一類具有多種功能的細(xì)胞因子,其調(diào)控著多樣的生理功能,如細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及EMT。其中TGF-β介導(dǎo)的EMT促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲。TGF-β信號(hào)通路本身的異常也可能引起人類腫瘤,它主要通過Smad或非Smad信號(hào)通路行使其生物學(xué)功能。
研究顯示Sma
3、d3作為TGF-β信號(hào)通路中一個(gè)重要的組成部分,它對(duì)于TGF-β介導(dǎo)的EMT、腫瘤抑制以及轉(zhuǎn)移極其重要。Smad3依賴的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制著大部分的TGF-β靶向基因。研究顯示Smad3可通過其介導(dǎo)的EMT加速腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。Smad3本身并不具備上述能力,而是通過其磷酸化形式發(fā)揮作用,后者進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。
MicroRNAs(MiRNAs)是一類由19到24個(gè)核苷酸組成的短鏈非編碼RNAs,其調(diào)節(jié)著基因的表達(dá),并
4、且通過翻譯抑制或下調(diào)靶基因的mRNA來影響蛋白質(zhì)的翻譯或影響mRNA的穩(wěn)定性。MiRNAs在基本的生物學(xué)過程中發(fā)揮作用,如細(xì)胞分化、增值、生存和死亡。其異常表達(dá)涉及腫瘤進(jìn)程的各方面,如腫瘤發(fā)生、凋亡抑制、腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移。報(bào)道顯示miR-145在多種腫瘤細(xì)胞中扮演著腫瘤抑制的作用。
本課題探討了miR-145和Smad3在NSCLC中的表達(dá)水平,miR-145與 Smad3相互作用的潛在機(jī)制,以及它們?cè)赥GF-β1介導(dǎo)的EMT中
5、的作用。為NSCLC的早期診斷和靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:
1.預(yù)測(cè)并驗(yàn)證miR-145的直接靶向結(jié)合基因Smad3
運(yùn)用預(yù)測(cè)軟件TargetScan、PicTar和mirBase查找、預(yù)測(cè)miR-145的靶基因Smad3。同時(shí)查找miR-145的成熟體序列、并合成miR-145的模擬體mimics,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549及95C細(xì)胞,通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后Smad3 mRNA的
6、表達(dá)變化;利用Western blot檢測(cè)Smad3蛋白的表達(dá)變化;最后通過雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-145是否與Smad33’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合。
2.miR-145靶向調(diào)控Smad3引起NSCLC細(xì)胞的生物學(xué)功能變化
通過qPCR檢測(cè)臨床病人NSCLC組織和對(duì)應(yīng)的癌旁組織中Smad3 mRNA和miR-145的相對(duì)表達(dá)量。qPCR和Western blot檢測(cè)包括人正常支氣管上皮細(xì)胞HBE在內(nèi)的6株
7、肺癌細(xì)胞(A549、H460、95D、95C和H1299)miR-145 mRNA、Smad3 mRNA和Smad3蛋白的相對(duì)表達(dá)量。用miR-145 mimics、inhibitor miR-145 mimics和Smad3-siRNA分別轉(zhuǎn)染A549及95C細(xì)胞;運(yùn)用Western blot檢測(cè)上述細(xì)胞株Smad3、E-cadherin、N-cadherin的蛋白表達(dá)水平;通過Transwell試驗(yàn)檢測(cè)上述基因?qū)SCLC細(xì)胞侵襲及
8、遷移的影響。
3.了解TGF-β1對(duì)上述生物學(xué)變化的影響
對(duì)上述轉(zhuǎn)染10h后的細(xì)胞加入TGF-β1,同樣方法檢測(cè)Smad3、p-Smad3、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達(dá)變化,以及TGF-β1對(duì)NSCLC細(xì)胞侵襲及遷移的影響變化。
結(jié)果:
1.miR-145直接靶向結(jié)合Smad3-3’UTR區(qū)域,調(diào)控Smad3的蛋白表達(dá)量。
miR-145 mimics轉(zhuǎn)染NSCL
9、C細(xì)胞后,Smad3 mRNA及 Smad3蛋白表達(dá)量均較對(duì)照組明顯下降。熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)證實(shí)了miR-145與Smad3-3’UTR區(qū)域的種子序列直接結(jié)合。
2.miR-145通過直接靶向調(diào)控Smad3引起NSCLC細(xì)胞的生物學(xué)功能變化。
在NSCLC組織中,Smad3 mRNA表達(dá)量較相應(yīng)的癌旁組織明顯上升(P<0.05),而miR-145的表達(dá)量較癌旁組織明顯下降(P<0.01)。與HBE細(xì)胞株相比,Sma
10、d3 mRNA和蛋白表達(dá)水平在NSCLC細(xì)胞株中明顯上升,而miR-145 mRNA的表達(dá)量明顯下降。用miR-145 mimics和Smad3-siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NSCLC細(xì)胞株,Western blot檢測(cè)顯示,相對(duì)于對(duì)照組,Smad3及N-cadherin蛋白表達(dá)量明顯下降、E-cadherin蛋白表達(dá)量明顯增加;侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)表明,與對(duì)照組相比,過表達(dá)miR-145或下調(diào)Smad3表達(dá)均能明顯抑制NSCLC細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。
11、而經(jīng)轉(zhuǎn)染inhibitor miR-145 mimics后的NSCLC細(xì)胞株則顯示了相反的蛋白結(jié)果和侵襲遷移結(jié)果。
3.TGF-β1增強(qiáng) NSCLC細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。
轉(zhuǎn)染miR-145 mimics或Smad3-siRNA組,與相應(yīng)的對(duì)照組相比,TGF-β1并未改變Smad3蛋白表達(dá)水平,但上調(diào)了p-Smad3和N-cadherin蛋白表達(dá)量、下調(diào)了E-cadherin蛋白表達(dá)量;與未加TGF-β1相比,侵襲及
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