非致死性機(jī)械創(chuàng)傷大鼠模型的制備.pdf

1、研究背景：隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，機(jī)械創(chuàng)傷的發(fā)生率逐年上升。嚴(yán)重的機(jī)械創(chuàng)傷對(duì)人類(lèi)生命安全和社會(huì)經(jīng)濟(jì)均構(gòu)成了威脅，所以，對(duì)嚴(yán)重創(chuàng)傷的救治一直是科研及臨床治療關(guān)注的焦點(diǎn)。然而，最近的臨床報(bào)道顯示，在某些創(chuàng)傷程度較輕的病例，創(chuàng)傷后在臨床觀察的24h內(nèi)一般情況良好，無(wú)直接心血管損傷，但出院后，仍可繼發(fā)心肌梗死或心臟功能減退，甚至導(dǎo)致死亡。因此，加強(qiáng)對(duì)非致死性機(jī)械創(chuàng)傷患者的關(guān)注，是社會(huì)發(fā)展提出的新的要求。目前用于制備機(jī)械創(chuàng)傷的動(dòng)物模型，大多是模擬致死

2、性創(chuàng)傷或局部創(chuàng)傷的，均不適應(yīng)在臨床上出現(xiàn)的傷后患者24內(nèi)一般狀態(tài)良好、但存在有潛在的心肌損傷(即，非致死性創(chuàng)傷)的病例。本研究的前期實(shí)驗(yàn)選用Noble-Collip鼓，以40rpm，持續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)5min制備的大鼠非致死性機(jī)械創(chuàng)傷模型發(fā)現(xiàn)：所制備的創(chuàng)傷模型于創(chuàng)傷后24h，雖然在體心功能正常，但將這個(gè)時(shí)間點(diǎn)的心臟取出，進(jìn)行離體心臟灌流實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠心功能顯著降低；創(chuàng)傷后6h時(shí)，大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生了顯著凋亡。以上結(jié)果提示，該模型可能繼發(fā)心臟功能降低

3、，且心肌細(xì)胞凋亡可能是創(chuàng)傷后繼發(fā)心臟功能降低的原因之一。然而此模型是否能模擬創(chuàng)傷后24h內(nèi)一般情況良好，無(wú)直接心臟損傷，但有可能繼發(fā)心臟功能降低的臨床患者，以及創(chuàng)傷后心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生規(guī)律如何，目前還不清楚。
　　 目的：⑴制備大鼠非致死性機(jī)械創(chuàng)傷模型，模擬機(jī)械創(chuàng)傷后24h內(nèi)一般情況良好，無(wú)直接心臟損傷，但有可能繼發(fā)心臟功能降低的臨床病例。⑵觀察非致死性創(chuàng)傷后，大鼠心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生的時(shí)間變化規(guī)律，為臨床選擇創(chuàng)傷后心肌損傷的治療時(shí)

4、機(jī)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：①選用健康雄性SD大鼠，隨機(jī)分為2組：A組和B組。②將大鼠麻醉后放入Noble-Collip鼓(直徑30.5cm)中，分別以20 rpm，持續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)5min，40rpm，持續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)5min，60rpm，持續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)8min45sec，制備輕、中、重三種不同程度機(jī)械創(chuàng)傷模型。③為了評(píng)估各組大鼠創(chuàng)傷后24h內(nèi)一般情況，觀察各組大鼠創(chuàng)傷后24h內(nèi)生存率，利用BL410生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)檢測(cè)大鼠心率(HR)、心電

5、圖(ECG)、平均動(dòng)脈壓(MABP)及心臟血流動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)：左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張壓(LVDP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左室最大收縮速率(+dP/dtmax)和左室最大舒張速率(-dP/dtmax)。④為了評(píng)估各組大鼠創(chuàng)傷后應(yīng)激反應(yīng)情況、炎癥活動(dòng)性及心肌細(xì)胞損傷情況，用ELISA法測(cè)定血清中腎上腺素、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)和心肌肌鈣蛋白I(cTnI)含量。⑤為了觀察創(chuàng)傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況及凋亡的時(shí)間規(guī)律

6、，對(duì)心肌組織進(jìn)行TUNEL染色和Caspase-3活性檢測(cè)。⑥為了明確心肌細(xì)胞凋亡是否繼發(fā)于創(chuàng)傷性休克，利用BL-410生物信號(hào)記錄分析系統(tǒng)檢測(cè)大鼠創(chuàng)傷后各時(shí)間點(diǎn)平均動(dòng)脈壓(MABP)。⑦為了明確心肌細(xì)胞凋亡是否繼發(fā)于肝臟功能損傷，利用Om-nilabTMBS-300全自動(dòng)生化分析儀，檢測(cè)大鼠創(chuàng)傷后各時(shí)間點(diǎn)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)和球蛋白(GLO)濃度，以及白球比(A/G)。
　　 結(jié)果：⑴輕

7、度創(chuàng)傷組和中度創(chuàng)傷組大鼠24h內(nèi)一般情況良好，重度創(chuàng)傷組大鼠24h內(nèi)一般情況差。輕度組和中度組創(chuàng)傷后24h生存率100％，創(chuàng)傷后0h心臟功能良好，與偽創(chuàng)組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。重度組創(chuàng)傷后24h內(nèi)6只大鼠死亡5只，創(chuàng)傷后0h心臟功能顯著降低，與偽創(chuàng)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1-8，P＜0.01)。以上結(jié)果提示，重度組不可用來(lái)模擬機(jī)械創(chuàng)傷后24h內(nèi)一般情況良好，無(wú)直接心臟損傷，但可能繼發(fā)心臟功能降低的臨床患者。⑵輕度創(chuàng)傷組和中度創(chuàng)傷組大鼠

8、血清中腎上腺素和超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)含量均增高，但兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與偽創(chuàng)組相比，輕度組和中度組創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)血清中腎上腺素和hs-CRP含量均逐步增高，兩種蛋白的血清濃度分別于創(chuàng)傷后72h和24h達(dá)高峰，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖9-12，P＜0.01)，但輕度組和中度組兩組之間進(jìn)行比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖13、14)。⑶輕度創(chuàng)傷組和中度創(chuàng)傷組血清中心肌肌鈣蛋白I(cTnI)含量均未增高與偽創(chuàng)組相比，輕度組和中度組創(chuàng)傷后不

9、同時(shí)間點(diǎn)血清中cTnI含量均未明顯增高(圖15、16)，即兩組心肌細(xì)胞未發(fā)生顯著壞死。⑷創(chuàng)傷后6h，輕度創(chuàng)傷組心肌細(xì)胞凋亡未增加，中度創(chuàng)傷組心肌細(xì)胞凋亡增加與偽創(chuàng)組相比，輕度組創(chuàng)傷后6h心肌細(xì)胞凋亡未發(fā)生明顯變化，中度組創(chuàng)傷后6h心肌細(xì)胞凋亡顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖17，P＜0.01)。以上結(jié)果提示，雖然從應(yīng)激反應(yīng)和炎癥活動(dòng)性?xún)煞矫鎭?lái)看，輕度組和中度組損傷程度無(wú)顯著差別，但從心肌損傷情況來(lái)看，中度組創(chuàng)傷后6h心肌細(xì)胞發(fā)生了顯著凋亡

10、。損傷程度較輕度組嚴(yán)重，很有可能繼發(fā)心臟功能降低。因此，中度組可用來(lái)模擬創(chuàng)傷后24h內(nèi)一般情況良好，無(wú)直接心臟損傷，但有可能繼發(fā)心臟功能降低的臨床患者。⑸中度創(chuàng)傷引起的心肌細(xì)胞凋亡隨時(shí)間呈規(guī)律性變化。與偽創(chuàng)組相比，中度組心肌組織中凋亡指數(shù)(TUNEL法檢測(cè))和Caspase-3活性在創(chuàng)傷后隨時(shí)間逐漸增高，其中，凋亡指數(shù)于創(chuàng)傷后12h達(dá)高峰，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖18，P＜0.01)；Caspase-3活性于創(chuàng)傷后6h達(dá)高峰，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

11、義(圖19，P＜0.01)。⑹中度創(chuàng)傷組創(chuàng)傷后平均動(dòng)脈壓(MABP)24h內(nèi)即恢復(fù)至正常。與偽創(chuàng)組相比，中度組MABP僅于創(chuàng)傷后0h短暫降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖20，P＜0.01)，創(chuàng)傷后3h即恢復(fù)。⑺中度創(chuàng)傷組血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量短暫升高，但肝臟合成功能均正常。與偽創(chuàng)組相比，中度組創(chuàng)傷后不同時(shí)間點(diǎn)血清中ALT含量有短暫升高，于創(chuàng)傷后3h達(dá)高峰，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖21，P＜0.01)；血清中總蛋白(圖22)、白蛋白(圖23

12、)和球蛋白濃度(圖24)，以及白球比(圖25)均無(wú)明顯變化，即肝臟雖有損傷但合成功能正常。以上結(jié)果提示，中度創(chuàng)傷引起的心肌細(xì)胞凋亡在創(chuàng)傷后一段時(shí)間內(nèi)隨時(shí)間延長(zhǎng)而增多。且中度組心肌細(xì)胞凋亡達(dá)高峰時(shí)(創(chuàng)傷后6h)，MABP已恢復(fù)至正常，肝臟合成功能正常，說(shuō)明中度創(chuàng)傷引起的心肌細(xì)胞凋亡并非繼發(fā)于創(chuàng)傷性休克和肝臟功能降低。
　　 結(jié)論：①利用Noble-Collip鼓，以40 rpm，轉(zhuǎn)動(dòng)5min制備的大鼠中度創(chuàng)傷模型，可用來(lái)模擬機(jī)械創(chuàng)