溫熱對HPV感染細胞中自噬的影響及機制探討.pdf

1、目的:人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)是屬于定向感染人體皮膚和黏膜的一類乳頭瘤病毒。根據(jù)病毒基因序列不同，HPV明確的亞型有120多種，且表現(xiàn)為明顯的組織特異性。皮膚型HPV引起的良性的臨床疾病為皮膚疣（瘤），粘膜型HPV則誘導良性乳頭狀瘤，可引起生殖器黏膜上皮腫瘤，如消化道、呼吸道的腫瘤。按其生物學行為不同可分高危型和低危型。HPV高危型可誘導發(fā)病率和死亡率較高的宮頸癌。然而無論何種型別的HPV，均具有

2、高度嗜上皮性并有促進角質形成細胞增殖的能力，引起皮膚和黏膜異常增生。HPV廣泛存在于自然界中，HPV感染具有極強的地域性，世界上不同國家地區(qū)HPV的感染率和分布不同。美國已注冊了3種針對HPV感染預防的疫苗，但對于人乳頭瘤病毒治療性疫苗相對于已上市的預防性疫苗進展緩慢，更具有挑戰(zhàn)性。主要原因是對機體如何進行自身控制及清除HPV感染的細胞的機制不清楚。根據(jù)HPV感染的亞型、部位不同，治療的方案也有所區(qū)別。因此，尋找有效的更加適合國人的預防

3、和治療HPV感染的方法尤為重要。
　　一定溫度、時間的溫熱對于一些疾病已有明確的療效。并且具有安全、無痛、可持續(xù)等優(yōu)點。因此更容易被患者接受，并在臨床上開展。現(xiàn)已在乳腺癌、肺癌等癌癥的治療過程中取得了確切的療效。近年來，溫熱在皮膚科也得到了充分研究與應用。如皮膚腫瘤、皮膚真菌感染、皮膚HPV病毒感染等。本實驗基于自主知識產權研發(fā)的溫熱治療儀（專利號zl200820231952.4.）的前期療效研究所做的統(tǒng)計分析，尤其在治療趾疣方面

4、，照比常規(guī)療法的治愈率高達近10個百分點。并利用該技術成功治療復雜性人乳頭瘤病毒感染性皮膚病和多種難治性其他疾病，并成功發(fā)表多篇SCI論著。研究證明溫熱可以使正常皮膚及HPV感染的皮膚發(fā)生凋亡，并且在后者發(fā)揮更大效果。通過研究，溫熱后發(fā)生凋亡主要原理可能是通過溶解角質形成細胞釋放HPV成分來促發(fā)特異性免疫系統(tǒng)從而消滅HPV。但對于如何發(fā)揮該作用的確切機理尚未明確。
　　最新研究證明溫熱可以誘發(fā)腫瘤細胞發(fā)生自噬，并呈溫度依賴性。細胞

5、自噬是通過清除體內功能紊亂的蛋白或受損的細胞器維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種重要降解過程。主要分為以下三種方式:1、大自噬;2、小自噬;3、分子伴侶介導的自噬。多種病理生理狀態(tài)均可誘導自噬的發(fā)生。自噬參與多種生物學功能的調控。自噬發(fā)生可通過多條信號調節(jié)途徑。最新的研究表明，自噬在感染性皮膚病、銀屑病、光損傷、自身免疫性疾病、皮膚惡性腫瘤中也起到重要的作用。
　　細胞增殖、衰老和死亡是構成體內穩(wěn)態(tài)平衡的重要機制，目前依據(jù)形態(tài)學的不同，將細胞死

6、亡分為凋亡、自噬和壞死。由于其種類的多樣性及機制的復雜性，它們之間不可避免存在交叉形成聯(lián)系，近年來越來越多證據(jù)顯示，細胞自噬跟凋亡在某些情況下存在協(xié)助或拮抗等關系。
　　基于以上理論基礎，溫熱可以誘發(fā)腫瘤細胞發(fā)生自噬，且可引起HPV感染的細胞發(fā)生凋亡，凋亡又與自噬之間存在協(xié)同拮抗等復雜關系，那是否可以證明自噬在溫熱治療HPV感染皮膚病中起著一定作用，尚需進一步研究，這將為溫熱治療HPV感染性疾病提供理論依據(jù)。
　　研究方法:

7、1、實驗對象:細胞系來自表達不同HPV拷貝數(shù)的宮頸癌細胞系(CaSki、SiHa、C33A)和永生化的人角質形成細胞系(HaCaT)作為研究對象。體外溫熱的組織標本來自于中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科門診臨床診斷為尖銳濕疣的患者，收集經二氧化碳點陣激光切除皮損部分的殘余。2、溫熱治療方案:體外溫熱:水浴鍋加熱，將尖銳濕疣組織一式兩份，浸潤至培養(yǎng)基內，分別給予37℃、44℃溫熱30分鐘處理，培養(yǎng)箱培養(yǎng)12小時。細胞溫熱:采用水浴鍋加熱方式

8、，方法同體外溫熱。3、實時熒光定量PCR檢測微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)和P62 mRNA的表達:采用實時熒光定量PCR方法檢測LC3，P62 mRNA的表達。按照Qiagen提取試劑說明書提取總RNA;用GoScriptTMReverse Transcription System(Promega)試劑盒反轉錄合成cDNA; GoTaq(@)qPCR Master Mix(Promega)試劑盒行實時熒光定量PCR擴增，并對結果進行分

9、析。4、Western blot檢測LC3蛋白的表達:采用Westernblot方法檢測溫熱前后LC3蛋白表達水平的變化（LC3是自噬的標志物，自噬一旦形成，胞漿型LC3，即LC3-Ⅰ會酶解掉一小段肽段，轉變膜性，即LC3-Ⅱ，而LC3-Ⅱ/Ⅰ比值大小可評估自噬水平高低）。應用BCA試劑盒提取細胞中蛋白并檢測蛋白濃度;經制膠、電泳、轉膜、封閉、一抗過夜、二抗等過程，最終進行顯色觀察。5、免疫組化檢測相關蛋白:石蠟切片4μm，用免疫組化染

10、色技術(SP法)檢測LC3表達。石蠟組織切片經多次脫蠟、抗原修復、一抗、二抗、顯色、復染等，在20倍物鏡下隨機選取5個視野，并用Image-pro Plus軟件分析平均光密度值。6、MTS檢測溫熱對細胞增殖的影響:利用MTS方法檢測溫熱對細胞增殖的影響。將四種細胞分別接種在96孔板中，分別進行37℃和44℃溫熱處理，分別于第0、1、2、和第3天進行吸光度值檢測。7、流式細胞術檢測溫熱對細胞周期的影響:利用流式細胞術檢測溫熱對細胞周期影響

11、。將細胞接種于六孔板中，分別進行37℃、44℃處理。之后應用PI試劑檢測細胞的周期的分布。8、統(tǒng)計學分析:采用GraphPad Prim軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析處理，統(tǒng)計學方法采用方差分析或unpaired t test。比較實驗組和對照組的差異，P值＜0.05認為有統(tǒng)計學差異。
　　結果:1、溫熱對細胞中自噬表達的影響:利用RT-PCR、Western-Blot方法觀察到三種不同拷貝數(shù)的宮頸癌細胞系及角質形成細胞在溫熱處理后自噬相

12、關基因、蛋白表達水平均有不同程度的增高。免疫組織化學方法觀察LC3在各組織中的表達情況。結果顯示，LC3在HPV感染皮膚組織中呈陽性表達，溫熱處理后表達水平增高。差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01)。2、溫熱對細胞增殖及周期的影響:44℃處理后，四種細胞的增殖水平對比37℃時有所下降，同時流式細胞術結果發(fā)現(xiàn)四種細胞在溫熱處理后，G2M期發(fā)生阻滯。
　　結論:1、溫熱可提高HPV感染細胞中自噬水平的表達。2、溫熱處理后抑制HPV感染細