HCV NS5A對(duì)干擾素誘導(dǎo)的STAT1磷酸化及核轉(zhuǎn)移的影響.pdf

1、目的：探討丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白5A(HCV NS5A)對(duì)干擾素α-2b誘導(dǎo)JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的STATl磷酸化及核轉(zhuǎn)移的影響，以了解HCV NS5A相關(guān)的干擾素抵抗可能的分子機(jī)制。 研究方法：以干擾素α-2b 10000U／ml誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞，測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(15min、30min、60min、2h、4h、8h)STATl磷酸化(Tyr701)狀態(tài)，以磷酸化最明顯時(shí)間點(diǎn)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。 用脂質(zhì)體Lipofe

2、ctmine<'TM>2000分別將p<'CNS5A>(表達(dá)HCV NS5A)和空質(zhì)粒P<'Rc／CMV>導(dǎo)入Huh7細(xì)胞，另設(shè)一組未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒為空白對(duì)照。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)開(kāi)始以下實(shí)驗(yàn)：(1)應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)HCV NS5A的表達(dá)。(2)用α—2b干擾素處理分別轉(zhuǎn)染p<'CNS5A>和P<,RC／CMV>以及未轉(zhuǎn)染三組細(xì)胞，條件為10000U／ml、37℃、5％CO<,2>孵育30min，免疫熒光法觀察各組間干擾素誘導(dǎo)的STAT

3、l磷酸化和核轉(zhuǎn)移有何不同；提取各組細(xì)胞總蛋白，通過(guò)蛋白印跡(Western Blot)方法比較各組磷酸化STATl(Tyr701)的表達(dá)量，進(jìn)一步印證免疫熒光的結(jié)果。 結(jié)果：免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示轉(zhuǎn)染了P<,CNS5A>質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)有HCVNS5A表達(dá)，棕黃色顆粒分布于胞漿中。轉(zhuǎn)染P<'RC／CMV組和未轉(zhuǎn)染組則無(wú)表達(dá)，證明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。以干擾素α-2b 10000U／ml誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞30min后磷酸化STATl的表達(dá)最

4、明顯，將該時(shí)間點(diǎn)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。各組細(xì)胞均以干擾素α-2b 10000U／ml誘導(dǎo)30min，免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒p<'RC／CMV>組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞核STATl染色陽(yáng)性(綠色熒光)，胞漿無(wú)熒光染色；轉(zhuǎn)染P<'CNS5A>質(zhì)粒組部分細(xì)胞的胞核為陰性而胞漿陽(yáng)性，部分細(xì)胞的核陽(yáng)性而胞漿陰性，說(shuō)明IFNα-2b激活JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑，使游離于胞漿中的STAT1在短時(shí)間內(nèi)轉(zhuǎn)移至核內(nèi)；而HCV NS5A抑制了IFNα誘導(dǎo)的STA

5、T1核轉(zhuǎn)移。我們進(jìn)一步采用磷酸化STAT1(Tyr701)抗體進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染p<'RC／CMV>組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞胞核染色陽(yáng)性，胞漿無(wú)熒光染色；轉(zhuǎn)染p<'CNSSA>質(zhì)粒組部分細(xì)胞的胞核陰性且胞漿亦陰性，另一部分核內(nèi)染色陽(yáng)性而胞漿無(wú)染色，說(shuō)明IFNα激活了JAK-STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑，使游離于胞漿中的STAT1在短時(shí)間內(nèi)磷酸化且轉(zhuǎn)移至核內(nèi)；HCVNS5A能抑制IFNα誘導(dǎo)的STAT1磷酸化及核轉(zhuǎn)移。Westem Blot檢

6、測(cè)IFNα誘導(dǎo)30min后各組細(xì)胞磷酸化STAT1(Tyr701)蛋白的表達(dá)，轉(zhuǎn)染HCV NS5A表達(dá)質(zhì)粒P<'CNS5A>的細(xì)胞磷酸化STAT1表達(dá)明顯低于轉(zhuǎn)染P<'RC／CMV>組和未轉(zhuǎn)染組，進(jìn)一步印證了免疫熒光的結(jié)果。說(shuō)明HCVNS5A對(duì)STAT1磷酸化存在抑制作用。 結(jié)論：成功的將HCV NS5A表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至Huh7細(xì)胞；α-2b干擾素誘導(dǎo)STAT1磷酸化并且轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，這種效應(yīng)可以被HCV NS5A抑