HCV NS5A對干擾素誘導的STAT1磷酸化及核轉移的影響.pdf

1、目的：探討丙型肝炎病毒非結構蛋白5A(HCV NS5A)對干擾素α-2b誘導JAK-STAT信號傳導途徑中的STATl磷酸化及核轉移的影響，以了解HCV NS5A相關的干擾素抵抗可能的分子機制。 研究方法：以干擾素α-2b 10000U／ml誘導Huh7細胞，測不同時間點(15min、30min、60min、2h、4h、8h)STATl磷酸化(Tyr701)狀態(tài)，以磷酸化最明顯時間點作為后續(xù)實驗條件。 用脂質體Lipofe

2、ctmine<'TM>2000分別將p<'CNS5A>(表達HCV NS5A)和空質粒P<'Rc／CMV>導入Huh7細胞，另設一組未轉染任何質粒為空白對照。轉染后48小時開始以下實驗：(1)應用免疫細胞化學技術檢測HCV NS5A的表達。(2)用α—2b干擾素處理分別轉染p<'CNS5A>和P<,RC／CMV>以及未轉染三組細胞，條件為10000U／ml、37℃、5％CO<,2>孵育30min，免疫熒光法觀察各組間干擾素誘導的STAT

3、l磷酸化和核轉移有何不同；提取各組細胞總蛋白，通過蛋白印跡(Western Blot)方法比較各組磷酸化STATl(Tyr701)的表達量，進一步印證免疫熒光的結果。 結果：免疫細胞化學法顯示轉染了P<,CNS5A>質粒的細胞內有HCVNS5A表達，棕黃色顆粒分布于胞漿中。轉染P<'RC／CMV組和未轉染組則無表達，證明質粒轉染成功。以干擾素α-2b 10000U／ml誘導Huh7細胞30min后磷酸化STATl的表達最

4、明顯，將該時間點作為后續(xù)實驗條件。各組細胞均以干擾素α-2b 10000U／ml誘導30min，免疫熒光實驗顯示轉染空質粒p<'RC／CMV>組和未轉染組細胞核STATl染色陽性(綠色熒光)，胞漿無熒光染色；轉染P<'CNS5A>質粒組部分細胞的胞核為陰性而胞漿陽性，部分細胞的核陽性而胞漿陰性，說明IFNα-2b激活JAK-STAT信號傳導途徑，使游離于胞漿中的STAT1在短時間內轉移至核內；而HCV NS5A抑制了IFNα誘導的STA

5、T1核轉移。我們進一步采用磷酸化STAT1(Tyr701)抗體進行免疫熒光實驗，結果顯示轉染p<'RC／CMV>組和未轉染組細胞胞核染色陽性，胞漿無熒光染色；轉染p<'CNSSA>質粒組部分細胞的胞核陰性且胞漿亦陰性，另一部分核內染色陽性而胞漿無染色，說明IFNα激活了JAK-STAT信號傳導途徑，使游離于胞漿中的STAT1在短時間內磷酸化且轉移至核內；HCVNS5A能抑制IFNα誘導的STAT1磷酸化及核轉移。Westem Blot檢

6、測IFNα誘導30min后各組細胞磷酸化STAT1(Tyr701)蛋白的表達，轉染HCV NS5A表達質粒P<'CNS5A>的細胞磷酸化STAT1表達明顯低于轉染P<'RC／CMV>組和未轉染組，進一步印證了免疫熒光的結果。說明HCVNS5A對STAT1磷酸化存在抑制作用。 結論：成功的將HCV NS5A表達質粒瞬時轉染至Huh7細胞；α-2b干擾素誘導STAT1磷酸化并且轉移至細胞核內，這種效應可以被HCV NS5A抑