HCV 1b亞型NS5A氨基酸變異對(duì)慢性丙型肝炎抗病毒治療的影響.pdf

1、研究背景和目的:
　　 丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus，HCV)感染可導(dǎo)致慢性肝病、肝硬化、肝細(xì)胞癌等，是肝臟疾病的主要原因之一。WHO評(píng)估目前全球約有1.8億人口感染HCV（感染率:3％）。我國(guó)人群抗-HCV陽(yáng)性率約為3.2％，全國(guó)約有4000萬(wàn)人感染HCV。聚乙二醇化干擾素(Pegylatedinterferon，PEG-IFN)聯(lián)合利巴韋林（Ribavirin，RBV）治療是目前慢性丙型肝炎（Chronic

2、hepatitis C，CHC或慢性丙肝）患者的標(biāo)準(zhǔn)方案。但此方案對(duì)HCV1b亞型的療效欠佳，持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答率(SVR)僅約為50％。
　　 在對(duì)HCV1b型基因序列的研究中，許多報(bào)道發(fā)現(xiàn)HCVNS5A蛋白多個(gè)區(qū)域的氨基酸(aminoacid，aa)序列突變與IFN、IFN/RBV的療效有關(guān)，這些區(qū)域包括ISDR(aa2209-2248)、PKRBD(aa2209-2274)、V3(aa2356-2379)、IRRDR(aa23

3、34-2379)。
　　 ISDR:1995年日本學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白5A區(qū)(NS5A)C端2209-2248位氨基酸突變數(shù)目可作為HCV1b型干擾素療效的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，干擾素應(yīng)答組患者的ISDR變異數(shù)目高于無(wú)應(yīng)答組病人。遂把HCVNS5A2209-2248氨基酸序列命名為干擾素敏感性決定區(qū)(IFNsensitivity-determiningregion，ISDR)。其重要的研究結(jié)論為:HCV1b型患者ISDR區(qū)氨基

4、酸序列與干擾素療效密切相關(guān)，與HCV-J相比，突變型（氨基酸變異≥4個(gè)）對(duì)干擾素敏感，中間型（氨基酸變異1-3個(gè)）和野生型（未變異）不敏感。此結(jié)論被日本的諸多后續(xù)研究證實(shí)，但是來(lái)自歐洲和美國(guó)的多項(xiàng)研究結(jié)果與這一結(jié)論存在矛盾之處。
　　 PKRBD:1997、1998年Gale等通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HCV抵抗IFNa主要是通過(guò)NS5A和PKR蛋白的相互作用，PKR蛋白是主要的宿主抗病毒蛋白之一。這種相互作用需要ISDR以及其后的26

5、個(gè)氨基酸殘基，該區(qū)域位于aa2209-2274，被稱為PKR-bindingdomain(PKRBD)。HCV1b型PKRBD變異與IFNa或IFNa/PEG-IFNa聯(lián)合RBV的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答明顯相關(guān)已有報(bào)道。
　　 V3和IRRDR:近些時(shí)候，Veillon和El-Shamy等研究發(fā)現(xiàn)HCVNS5A的V3區(qū)(aa2356-2379)，以及V3加上其N端側(cè)翼區(qū)，被稱為Interferon/ribavirinresistance

6、determiningregion（IRRDR;aa2334-2379）存在高度變異現(xiàn)象，V3和IRRDR的氨基酸變異與IFNa和RBV治療的應(yīng)答有關(guān)。更有2009年Bouzgarrou等報(bào)道NS5A從ISDR至V3(aa2209-2379)的氨基酸變異能夠影響抗病毒治療的應(yīng)答。
　　 IFNa的經(jīng)典信號(hào)通路是通過(guò)JAK/STAT途徑。Ⅰ型IFN與相應(yīng)的受體結(jié)合，激活信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)一系列干擾素刺激基因(ISGs)的轉(zhuǎn)錄翻

7、譯，而翻譯的一些蛋白因子具有抗病毒活性，如PKR、MxA、ISG15等。蛋白激酶PKR在RNA病毒基因復(fù)制時(shí)可與dsRNA結(jié)合而激活，激活后能夠磷酸化翻譯啟始因子eIF-2a亞單位的51位絲氨酸殘基，使磷酸化的eIF-2a無(wú)法參與蛋白多肽鏈的翻譯過(guò)程，從而抑制病毒或細(xì)胞蛋白的合成，達(dá)到抗病毒的效果。而Gale等通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明NS5A蛋白通過(guò)PKRBD，能夠結(jié)合IFNa誘導(dǎo)產(chǎn)生的PKR。HCVNS5A蛋白與宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶PKR的相互

8、作用對(duì)細(xì)胞內(nèi)干擾素刺激基因(ISGs)的翻譯起著重要抑制作用。綜上所述，HCV1b型NS5A關(guān)鍵區(qū)域發(fā)生氨基酸突變的數(shù)目不同，則干擾NS5A-PKR蛋白相互作用的程度不同，進(jìn)而不同程度地影響干擾素發(fā)揮其療效。
　　 除過(guò)日本，來(lái)自亞洲其他國(guó)家和地區(qū)的相關(guān)研究報(bào)道極少，尤其是中國(guó)大陸的研究報(bào)道。所以，本研究的目的是首先確定是否治療前HCV1b亞型感染患者的NS5A的氨基酸變異與PEG-IFN聯(lián)合RBV治療療效有關(guān)。分析聚焦于NS5

9、A區(qū)的ISDR、PKRBD、IRRDR和V3四個(gè)功能區(qū)域。同時(shí)篩選NS5A關(guān)鍵區(qū)域變異數(shù)目不同的合適的臨床毒株構(gòu)建HCV重組replicon，建立HCV復(fù)制子細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，對(duì)HCVNS5A不同氨基酸變異數(shù)目與以IFN為基礎(chǔ)抗病毒治療應(yīng)答的機(jī)理進(jìn)行初步探討。
　　 第一部分:HCV1b型NS5A全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增和克隆構(gòu)建
　　 研究方法:
　　 采用RT-PCR技術(shù)從53例臨床丙型肝炎患者血標(biāo)本中擴(kuò)增HCV1b型NS

10、5A全長(zhǎng)基因，測(cè)序分析，MEGA4軟件比對(duì)其與HCVJ株(GenBank注冊(cè)號(hào):D90208)病毒NS5A蛋白PKRBD、ISDR、V3和IRRDR區(qū)的氨基酸突變數(shù)目和位點(diǎn)，了解廣東HCV1b亞型NS5A氨基酸突變情況。同時(shí)根據(jù)NS5A測(cè)序結(jié)果，挑選合適的NS5A基因片段與pMD18-T載體連接，構(gòu)建pMD18-NS5A克隆。
　　 統(tǒng)計(jì)分析軟件應(yīng)用SPSS17.0，統(tǒng)計(jì)描述采用頻數(shù)表示，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表

11、示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，進(jìn)行Levene方差齊性分析，方差齊同條件下采用t檢驗(yàn)，方差不齊條件下采用Satterthwaite近似t檢驗(yàn)。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.HCV1b亞型NS5A基因成功擴(kuò)增，全長(zhǎng)1477bp，pMD18-NS5A克隆成功構(gòu)建。
　　 2.廣東地區(qū)HCV1b亞型NS5A的ISDR區(qū)氨基酸突變率為73.6％(39/53)，ISDR突變數(shù)目超過(guò)4個(gè)以上的僅占1

12、.9％(1/53)，其余均為為野生型和中間型。PKRBD氨基酸殘基突變數(shù)目5.7±1.4，V3氨基酸殘基突變數(shù)目4.9±1.1，IRRDR氨基酸殘基突變數(shù)目5.7±1.5。
　　 3.HCV1b型NS5A氨基酸突變數(shù)目與性別、年齡和傳播途徑的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示:年齡分組（≥50歲/＜50歲）與V3區(qū)氨基酸變異數(shù)目有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=0.555，P=0.033），年齡分組（≥50歲/＜50歲）與IRRDR區(qū)氨基酸變異數(shù)目有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差

13、異(t=0.288，P=0.041)，說(shuō)明感染HCV年紀(jì)較大的患者IRRDR和V3區(qū)氨基酸變異較多，而ISDR和PKRBD區(qū)無(wú)顯著差異（P=0.222和P=0.081）。NS5A氨基酸突變數(shù)目與性別和傳播途徑無(wú)關(guān)(P＞0.05)。
　　 第二部分:HCVNS5A變異對(duì)Peg-IFN/RBV治療1b亞型CHC療效的影響
　　 研究方法:
　　 對(duì)廣東地區(qū)53例HCV1b亞型感染的慢性丙型肝炎患者，經(jīng)PEG-IFN/

14、RBV標(biāo)準(zhǔn)方案（40例經(jīng)180μg/次或135μg/次pegylatedIFN-α-2a聯(lián)合RBV800-1200mg/日方案，13例經(jīng)80μg/次pegylatedIFN-α-2b聯(lián)合RBV800-1200mg/日方案）治療48周隨訪24周，進(jìn)行回顧性研究。分析HCVNS5Aaa變異及其影響抗病毒治療應(yīng)答的特點(diǎn)。分析主要聚焦于NS5A區(qū)的ISDR、PKRBD、IRRDR和V3功能區(qū)域。
　　 統(tǒng)計(jì)分析軟件應(yīng)用SPSS17.0，

15、統(tǒng)計(jì)描述采用頻數(shù)表示，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);分類變量比較采用x2檢驗(yàn);二分類Logistic回歸用于分析與SVR有關(guān)的各種因素。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.53例慢性丙型肝炎患者采用PEG-IFN聯(lián)合RBV治療48周并隨訪24周，EVR、ETVR和SVR分別是69.8％(37/53)、73.6％(39/53)和50.9％(27/53)。治療前基線

16、特征中年齡與SVR有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=3.499，P=0.001)，PLT與SVR有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-2.611，P=0.0120)，EVR與SVR有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=6.173，P=0.013)，ETVR與SVR有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=19.757，P=0.000)。EVR和ETVR作為IFN的預(yù)測(cè)因素已被廣泛接受。本研究顯示PLT與SVR相關(guān)(P=0.012)，分析原因是由于患者基線特征的差異所致，因?yàn)楂@得SVR的27例患

17、者中有6例為肝硬化(22.2％)，而26例未獲得SVR的患者中有10例為肝硬化(38.5％)。進(jìn)一步年齡分組比對(duì)，≥50歲組的CHC患者SVR率比＜50歲組的SVR率低(P=0.008)，但是兩組都可以獲得較高的EVR和ETVR。提示對(duì)于獲得了ETVR的≥50歲的CHC患者，延長(zhǎng)療程至72周或更長(zhǎng)，可能提高SVR。
　　 2.ISDRaa突變數(shù)目與SVR有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（1.3±1.1對(duì)0.6±0.5;t=-3.095，P=0.

18、003）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)ISDRaa突變數(shù)目≥2組與＜2組之間SVR率存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=7.767，P=0.005)。研究結(jié)果顯示采用PEG-IFN/RBV抗病毒治療，ISDR氨基酸突變數(shù)目不僅能夠預(yù)測(cè)SVR，更為重要的是，ISDRaa變異數(shù)目由既往Enomoto報(bào)道的4個(gè)降為2個(gè)即可對(duì)SVR進(jìn)行有效預(yù)測(cè)。經(jīng)與Meta分析結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，采用PEG-IFN/RBV聯(lián)合方案，主要提高了既往HCV1b亞型感染患者ISDRaa突變中間型

19、的SVR。
　　 3.PKRBDaa突變數(shù)目與SVR有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(6.1±1.7對(duì)5.3±0.7;t=-2.315，P=0.027)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)PKRBDaa突變≥6組與＜6組之間的SVR率存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=4.259，P=0.039)。研究結(jié)果說(shuō)明PKRBDaa序列的變異數(shù)與PEG-IFN/RBV療效明顯正相關(guān)，變異數(shù)≥6的病例所獲得的SVR顯著高于其他病例，從臨床的角度支持Gale等的研究結(jié)果。
　　

20、 4.對(duì)于V3、IRRDR以及整個(gè)NS5A(ISDR-V3)區(qū)，統(tǒng)計(jì)分析未發(fā)現(xiàn)其氨基酸突變與病毒學(xué)應(yīng)答有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.819、P=0.949和P=0.244）。
　　 5.廣東HCV1b亞型NS5A區(qū)單個(gè)氨基酸突變的常見(jiàn)位點(diǎn)為2218、2257、2259、2260、2262、2265、2268、2270、2271、2336、2351、2356、2360、2367、2368、2372、2373、2375和2378。統(tǒng)計(jì)分

21、析未發(fā)現(xiàn)上述單個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變與PEG-IFN/RBV治療療效有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），有必要增加病例數(shù)進(jìn)行深入研究。
　　 6.Logistic回歸分析結(jié)果顯示:影響SVR的最主要因素是ISDRaa突變數(shù)目（OR=9.2，P=0.006），其次為年齡(OR=0.9，P=0.006)。
　　 第三部分:HCV1b亞型NS5A插入式復(fù)制子重組質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 研究方法:
　　 以能夠高效復(fù)制的HCV1

22、breplicon質(zhì)粒為骨架，構(gòu)成帶有MIuI和BclI雙酶切位點(diǎn)的拉鏈質(zhì)粒，前期采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)從不同CHC患者血清中擴(kuò)增獲得HCV1b亞型NS5A全長(zhǎng)片段，克隆到pMD-18載體中，測(cè)序分析其中的PKRBD、ISDR、V3和IRRDR區(qū)域的變異情況，挑選重要區(qū)域aa突變數(shù)目不同的NS5A片段，插入到此HCVreplicon拉鏈質(zhì)粒中。擴(kuò)增產(chǎn)物中無(wú)MIuI和BclI酶切序列的，在引物中引入相關(guān)酶切序列后再擴(kuò)增，

23、雙酶切后將NS5A區(qū)段置換入HCV1breplicon骨架中，構(gòu)建包含中國(guó)NS5A區(qū)段的插入式復(fù)制子重組質(zhì)粒。
　　 結(jié)果:
　　 分析Dr.Z.Huang惠贈(zèng)的HCV1breplicon質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)其NS5A區(qū)具有MIuI和BclI的單一酶切位點(diǎn)，雙酶切移去質(zhì)粒中原有的NS5A后（此時(shí)暫稱為HCVreplicon拉鏈質(zhì)粒），可以方便地插入從具有不同臨床抗病毒治療結(jié)局的CHC患者血清標(biāo)本中克隆出的HCVNSSA，進(jìn)而在細(xì)胞

24、培養(yǎng)中深入分析不同來(lái)源的NS5A的生物學(xué)特點(diǎn)，闡明其與抗病毒藥物療效之間的關(guān)系。本研究從克隆的NS5A全長(zhǎng)片段中挑選重要區(qū)域aa突變數(shù)目不同的3個(gè)片段，插入到HCVreplicon拉鏈質(zhì)粒中，成功構(gòu)建了包含中國(guó)NS5A區(qū)段的插入式復(fù)制子重組質(zhì)粒，為研究中國(guó)HCV1b亞型NS5A蛋白的生物學(xué)功能、難治性CHC干擾素抵抗的機(jī)制以及個(gè)體化抗病毒治療相關(guān)因素的分析奠定了的基礎(chǔ)。
　　 第四部分:HCVNS5A變異與以IFN為基礎(chǔ)抗病毒治

25、療應(yīng)答機(jī)理的初步探討
　　 研究方法:
　　 通過(guò)將各個(gè)HCV1b亞型NS5A插入式復(fù)制子重組質(zhì)粒進(jìn)行ScaI單酶切線性化，體外轉(zhuǎn)錄成RNA，轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞，利用熒光素酶檢測(cè)鑒定不同時(shí)間點(diǎn)HCVRNA的瞬時(shí)表達(dá)，經(jīng)G418篩選得到含有HCVRNA穩(wěn)定復(fù)制的Huh7.5.1細(xì)胞，利用RT-PCR法和免疫熒光檢測(cè)鑒定細(xì)胞中HCVNS5A的基因和蛋白表達(dá)，驗(yàn)證各重組replicon質(zhì)粒是否能夠正常工作。
　　

26、 用干擾素α-2b0IU/ml、25IU/ml、50IU/ml、100IU/ml、200IU/ml和400IU/ml;RBV0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml和80μg/ml;IFN/RBV不同方案:IFN25IU/ml+RBV10μg/ml、IFN50IU/ml+RBV10μg/ml和IFN100IU/ml+RBV10μg/ml，分別干預(yù)負(fù)載有重組replicon的Huh7.5.1細(xì)胞48h后，

27、收集細(xì)胞裂解液，測(cè)定熒光素酶活性，從而通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證臨床研究的結(jié)果，對(duì)其機(jī)理做初步探討。
　　 統(tǒng)計(jì)分析軟件用SPSS17.0，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，不同濃度和方案的藥物干預(yù)Huh7.5.1，三組間采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，同時(shí)對(duì)每個(gè)濃度藥物、每個(gè)方案干預(yù)Huh7.5.1的結(jié)果采用one-wayANOVA方法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，方差齊同條件下，采用LSD法對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比

28、較，方差不齊條件下，采用Dunnett'T3方法對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.經(jīng)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)各重組replicon轉(zhuǎn)染Huh7.5.1的瞬時(shí)表達(dá)效率，通過(guò)G418篩選得到含有HCVRNA穩(wěn)定復(fù)制的Huh7.5.1細(xì)胞，利用RT-PCR法和免疫熒光檢測(cè)鑒定細(xì)胞中HCVNS5A的基因和蛋白表達(dá)，證明重組的HCVreplicon能夠正常工作，可用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

29、　　 2.用不同濃度的IFN和RBV分別干預(yù)負(fù)載有重組replicon的Huh7.5.1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)三組的熒光素酶活性均呈現(xiàn)劑量依賴性的下降，說(shuō)明IFN和RBV對(duì)HCVRNA復(fù)制的抑制作用呈劑量依賴性增加。以不同濃度的IFN處理HCV復(fù)制子細(xì)胞后，析因設(shè)計(jì)資料的方差分析結(jié)果顯示:不同組間有顯著差異(F=5.432，P=0.009)。不同藥物濃度間有顯著差異（F=583.930，P=0.000）。對(duì)每個(gè)濃度干預(yù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，三組的one

30、-wayANOVA分析顯示:在100IU/ml濃度時(shí)，三組有顯著性差異（F=6.588，P=0.031），在200IU/ml濃度時(shí)，三組有顯著性差異(F=34.220，P=0.010)。多重比較發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)這2個(gè)藥物濃度干預(yù)后，NS5A-3組的熒光素酶活性都是最低水平。說(shuō)明HCVNS5A關(guān)鍵區(qū)域PKRBD/ISDR區(qū)發(fā)生氨基酸突變較多毒株，對(duì)IFN治療的反應(yīng)敏感。
　　 3.用不同方案的IFN聯(lián)合RBV進(jìn)行了干預(yù)實(shí)驗(yàn)，采用不同方案干

31、預(yù)Huh7.5.1，析因設(shè)計(jì)資料的方差分析結(jié)果顯示:不同組間有顯著差異(F=10.579，P=0.001)。對(duì)每個(gè)濃度干預(yù)時(shí)，三組的one-wayANOVA分析顯示:IFN50IU/ml+RBV10μg/ml方案下，三組比較有顯著性差異(F=8.565，P=0.017)，多重比較發(fā)現(xiàn)NS5A-1組病毒量顯著高于NS5A-2組和NS5A-3組，說(shuō)明HCVNS5A關(guān)鍵區(qū)域PKRBD/ISDR區(qū)發(fā)生氨基酸突變的replicon，對(duì)聯(lián)合用藥反應(yīng)

32、敏感。而而IFN100IU/ml+RBV10μg/ml方案下，三組比較有顯著性差異（F=14.317，P=0.005），多重比較顯示組間兩兩比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而NS5A-3組的病毒量最低，NS5A-2組居中。說(shuō)明聯(lián)合用藥方案情況下，HCV對(duì)以IFN為基礎(chǔ)的聯(lián)合抗病毒治療的反應(yīng)敏感，并且HCVNS5A關(guān)鍵區(qū)域PKRBD/ISDR區(qū)變異數(shù)目越多，對(duì)藥物的反應(yīng)越好，這些發(fā)現(xiàn)與我們前期的研究結(jié)果相符合。
　　 結(jié)論:
　　 1.

33、本研究表明:HCV1b亞型NS5A氨基酸變異與以干擾素為基礎(chǔ)的抗病毒治療應(yīng)答密切相關(guān)，關(guān)鍵區(qū)域集中在NS5A的ISDR和PKRBD區(qū)。并且采用PEG-IFN聯(lián)合RBV標(biāo)準(zhǔn)方案治療，ISDR氨基酸突變對(duì)治療應(yīng)答的預(yù)測(cè)可由4個(gè)降為2個(gè)。而實(shí)驗(yàn)部分也證明:對(duì)于HCV1b型NS5A區(qū)PKRBD/ISDR變異數(shù)目較多的病毒株，采用IFN聯(lián)合RBV用藥干預(yù)較單用IFN干預(yù)，治療反應(yīng)會(huì)更加敏感，并且HCVNS5A關(guān)鍵區(qū)域PKRBD/ISDR區(qū)變異數(shù)目