中華鱉Foxl2基因克隆與表達及溫度和外源激素對其表達的影響.pdf

1、在漫長的生命進化過程，性別的遺傳是高度保守的，但在基因型性別決定（Geneotypic sex determination，GSD）較為完善的生物類群演化出環(huán)境型性別決定（Environmental sex determination，ESD），它們在生命歷程中的關系，對認識生命演化規(guī)律具有重要意義。ESD類群的性別決定受溫度、激素的影響已被報道，在爬行動物中，溫度決定后代性別現(xiàn)象十分普遍，性別相關基因更有可能被外源激素和溫度所干擾，而

2、關于中華鱉Foxl2基因此方面具體應答變化還不清楚。
　　中華鱉（Pelodiscus sinensis）是一種被廣泛養(yǎng)殖的名特品種，隸屬于爬行綱、龜鱉目、鱉科（Trionychidae）、鱉屬（Pelodiscus）。中華鱉雄性個體比雌性個體生長速度快近1/3，裙邊寬厚，膠質含量高，深受市場歡迎，因此，在生產中孵化出更高比例的雄性個體對中華鱉養(yǎng)殖業(yè)具有非常重要的意義，本實驗對中華鱉性別決定分子機制的研究可為其打下堅實的理論基礎。

3、
　　Foxl2（winged helix/forkhead transcription factor gene2）屬翼狀螺旋/叉頭轉錄因子家族，已在多種物種獲得其基因序列，被認為主要參與與卵巢早期發(fā)育、分化以及成體卵巢功能的維持，屬于雌性相關基因，而關于中華鱉尚未見到相應的報道。
　　為中華鱉性別決定分子機制的研究提供生物學資料，本實驗采用克隆、表達和定量RT-PCR等技術對Foxl2基因的序列特征、不同發(fā)育時期時空表達以

4、及溫度和外源激素對其不同發(fā)育時期表達的影響進行了研究。結果如下：
　　1、Foxl2基因的生物信息學分析
　　通過RT-PCR方法獲得 Foxl2基因中間cDNA序列（Gen Bank Accession No.KP734210），中華鱉Foxl2 cDNA的蛋白質編碼區(qū)為903 bp，開放閱讀框編碼300個氨基酸，包括 DNA結合域（Fork-head(FH)-domain）；將中華鱉 Foxl2氨基酸序列與其它物種進行同

5、源性比對，結果顯示脊椎動物Foxl2 FH結構域高度保守；根據(jù)NCBI網站的BLASTP進行氨基酸序列分析，中華鱉與龜鱉類同源性最近，尤其與紅耳龜，構建各物種Foxl2氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹，結果則顯示中華鱉與西部錦龜遺傳距離最近；本實驗發(fā)現(xiàn)中華鱉Foxl2基因和其它非哺乳動物一樣缺少14個丙氨酸組成的聚丙氨酸區(qū)和甘氨酸-脯氨酸重復區(qū)。
　　2、中華鱉Foxl2基因克隆和組織表達研究
　　RT-PCR結果顯示Foxl2基因在

6、卵巢組織強烈表達，其次在腦、脾臟、眼睛、腎臟、肌肉、肝臟、心臟等組織也有一定程度表達；此外精巢也有微弱表達，且顯著低于卵巢中的表達量，性腺的表達呈現(xiàn)明顯的性別二態(tài)性，表明中華鱉Foxl2基因與雌性性腺發(fā)育密切相關。
　　3、E2和MT對中華鱉Foxl2表達的影響
　　為了研究外源激素和Foxl2基因的關系，對中華鱉注射雌二醇（E2）和甲基睪酮（MT），并在6 h、12 h、24 h、48 h、7 d和14 d分別檢測雌雄個體

7、 Foxl2的表達水平。結果顯示E2上調Foxl2表達；MT對Foxl2的表達沒有明顯差異.表明Foxl2的表達具有激素依賴性。
　　4、E2、MT和溫度對中華鱉胚胎發(fā)育階段Foxl2基因的表達探究
　　本實驗研究了中華鱉在26.5℃和32℃條件下Foxl2表達規(guī)律。定量RT-PCR結果發(fā)現(xiàn)，在12 h以前Foxl2表達最高，隨著胚胎發(fā)育，其表達顯著降低，直至34 d，32℃組表達量明顯高于26.5℃表達量，F(xiàn)oxl2在32