栽培煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株的研究和煙草抗病相關(guān)基因NtEIF4E與NtTOM3的敲除和鑒定.pdf

1、植物原生質(zhì)體是除去細(xì)胞壁僅由細(xì)胞膜包裹的裸露細(xì)胞。煙草原生質(zhì)體遺傳表達(dá)系統(tǒng)作為研究基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控、基因瞬時(shí)表達(dá)和信號(hào)通路的一種重要工具廣泛應(yīng)用，也是在細(xì)胞水平上研究植物分子機(jī)制和植物病毒感染的理想實(shí)驗(yàn)材料；此外，原生質(zhì)體再生植株體系，也是實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞遺傳操作以及加快分子育種進(jìn)程的重要基礎(chǔ)。
　　煙草是一種重要的模式植物和經(jīng)濟(jì)作物。煙草抗病相關(guān)基因的研究有助于了解植物對(duì)病蟲害的防御機(jī)制，并且減少病蟲害對(duì)煙草產(chǎn)量造成的損失。馬鈴薯Y病毒（

2、Potato virus Y，PVY）和煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是危害國(guó)內(nèi)煙草種植業(yè)的優(yōu)勢(shì)病毒，對(duì)煙草的產(chǎn)量造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。病毒浸染植株時(shí)，病毒需要依賴宿主細(xì)胞提供復(fù)制和翻譯的場(chǎng)所以及能量的供應(yīng)，其感染過(guò)程即是病毒與植物的互作的產(chǎn)物。下調(diào)這類宿主基因即可有效的抑制相關(guān)病毒的感染和傳播。已有研究結(jié)果顯示，EIF4E和TOM3基因分別是協(xié)助PVY和TMV病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵基因。
　　本研究

3、以栽培煙草作為原生質(zhì)體分離、純化和再生體系構(gòu)建的材料，對(duì)相關(guān)的影響因素進(jìn)行了研究，獲得了產(chǎn)量較高、質(zhì)量較好的原生質(zhì)體，并獲得了栽培煙草再生植株。另一方面，使用Crispr/Cas9敲除系統(tǒng)敲除NtEIF4E和NtTOM3基因，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，為研究栽培煙草抵抗PVY和TMV病毒的感染奠定了基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下：
　　1.栽培煙草原生質(zhì)體的分離和純化
　　構(gòu)建了栽培煙草紅花大金元原生質(zhì)體分離純化系統(tǒng)。使用纖維素酶和離析

4、酶酶解八周左右煙草無(wú)菌幼苗的細(xì)胞壁，去除葉尖和葉脈組織后將葉片切成1-2厘米的絲狀，與酶液混合恒溫培養(yǎng)12小時(shí)。去除殘余物質(zhì)后多次離心后即可得到純凈的原生質(zhì)體。
　　2.栽培煙草原生質(zhì)體再生體系的構(gòu)建
　　成功構(gòu)建了紅花大金元原生質(zhì)體再生體系。主要探究了pH值和甘露醇濃度對(duì)煙草原生質(zhì)體分裂的影響，發(fā)現(xiàn)在pH5.8和0.5M甘露醇條件下，煙草原生質(zhì)體分裂效果最佳。從原生質(zhì)體到完整植株所需培養(yǎng)時(shí)間為200天左右。
　　3.

5、栽培煙草原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和檢測(cè)
　　使用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體。我們發(fā)現(xiàn)Sigma公司生產(chǎn)的PEG4000最適合用于栽培煙草紅花大金元的轉(zhuǎn)化。同時(shí)，我們也發(fā)現(xiàn)小片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率高于大片段的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化所需時(shí)間也低于大片段質(zhì)粒。
　　4.煙草NtEIF4E和NtTOM3敲除載體構(gòu)建和突變檢測(cè)
　　由于實(shí)驗(yàn)室已建立成熟的CRISPR/CAS9基因敲除系統(tǒng)，我們成功的構(gòu)建了紅花大金元抗煙草花葉病毒相關(guān)基因NtTOM

6、3和K326抗馬鈴薯Y病毒相關(guān)基因NtEIF4E的CRISPR/CAS9敲除載體9個(gè)，經(jīng)檢測(cè)，基因敲除呈陽(yáng)性，并最終獲得了轉(zhuǎn)基因植株7株。NtEIF4E敲除植株中發(fā)現(xiàn)三個(gè)靶位點(diǎn)產(chǎn)生突變，三個(gè)靶位點(diǎn)檢測(cè)的突變形式各有差異，靶位點(diǎn)1主要為增加一個(gè)堿基A，靶位點(diǎn)2主要為單個(gè)堿基的突變，靶位點(diǎn)3則主要為刪除一個(gè)堿基G；NtTOM3敲除植株僅檢測(cè)到一個(gè)靶位點(diǎn)產(chǎn)生突變，主要形式為堿基的刪除，檢測(cè)到的刪除形式主要為在距離PAM前面6個(gè)堿基中刪除一個(gè)至