大蒜原生質體融合與培養(yǎng)技術研究.pdf

1、試驗于2008-2010年在山東農業(yè)大學科技創(chuàng)新園和農業(yè)部園藝作物重點開放實驗室進行。研究探討了大蒜鱗莖愈傷組織誘導的影響因素，利用獲得的胚性愈傷組織建立了懸浮細胞系，在此基礎上研究了原生質體分離、純化的影響因素，并初步開展了原生質體培養(yǎng)和融合研究。主要研究結果如下：
　　 1研究表明2，4-D在大蒜愈傷組織誘導及繼代培養(yǎng)中起關鍵作用。MS+2，4-D2㎎/L+6-BA1㎎/L利于大蒜愈傷組織的產生，MS+NAA1㎎/L+6-B

2、A0.1㎎/L是適宜于愈傷組織增殖和芽分化的最佳培養(yǎng)基。無激素的培養(yǎng)基利于生根；繼代2次的愈傷組織的芽分化能力最強。高濃度的生長素有利于大蒜愈傷組織的誘導，但并不利于其分化。
　　 2影響大蒜組織培養(yǎng)的因素：（1）外植體類型：分別以大蒜鱗芽基部、中部、頂部為外植體誘導愈傷組織?；亢椭胁空T導胚性愈傷組織的最佳培養(yǎng)基MS+2，4-D2㎎/L+6-BA0.5㎎/L。MS+2，4-D1.5㎎/L為鱗芽頂部愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基，誘導

3、率為78.3％。（2）大蒜品種：蘇聯(lián)蒜，蒼山蒜和金蒜3號三種基因型中以蒼山蒜的出愈率最高，為78.12％，明顯高于蘇聯(lián)蒜、金蒜3號。（3）培養(yǎng)基類型：三種類型培養(yǎng)基中以MS培養(yǎng)基的出愈率（82.35％）最高，與B5培養(yǎng)基（68.09％）和1/2MS（62.50％）差異顯著。
　　 3以胚性愈傷組織為材料，建立了胚性懸浮細胞系。胚性愈傷組織轉入液體培養(yǎng)基時，不同基因型大蒜品種建立穩(wěn)定的懸浮細胞系所需時間相差不大。細胞個數(shù)基本成S型

4、變化。懸浮培養(yǎng)階段細胞鮮、干重的測定結果表明，培養(yǎng)前期細胞生長速度快，并于第16d達到峰值。
　　 4從懸浮細胞系、胚性愈傷組織、組培葉片分離得到原生質體。繼代5d的大蒜懸浮細胞系是原生質體分離的最佳材料，其次是愈傷組織，而從組培苗葉片分離的原生質體產量和活力最低。以懸浮細胞系為分離材料的酶液組成為：2.0％Cellulase Onozuka R-10（纖維素酶）+0.2％PectolgaseY-23（果膠酶）+0.55 mol

5、/L甘露醇+5mM MES+10mM Cacl2（pH5.8）。分離大蒜懸浮細胞系原生質體宜采用低速（90rpm）恒溫（25±1）℃搖床振蕩酶解，時間為5h。純化時，1000r/min轉速下離心5min，能收集到大量有活力的原生質體。適當提高離心力的短時間離心有利于原生質體純化過程中產量和活力的保持。
　　 5原生質體培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)：采用液體淺層培養(yǎng)的培養(yǎng)效果最好，培養(yǎng)基成分為：1/2MS+1㎎/L2.4-D+0.5㎎/L6-BA