尿毒癥患者中自然殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)基因的實驗研究.pdf

1、研究背景:現(xiàn)代免疫抑制劑的使用,加之移植前通過組織配型的供受體的合理選擇,使得腎移植的存活率非常高,一些單位其1年存活率高達90％以上。然而,這種情況下,急性排斥反應(yīng)仍然發(fā)生,且常導(dǎo)致不可逆的移植物功能損害或移植物失功。因此,器官移植的成功有賴于防止急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。T細胞和B細胞分別作為介導(dǎo)排斥反應(yīng)的細胞免疫和體液免疫的主要成分已經(jīng)被廣泛地研究。移植中自然殺傷(NK)細胞的重要性隨著對其研究加深,也漸成為一個感興趣的介導(dǎo)排斥反應(yīng)物的

2、領(lǐng)域。NK細胞能殺傷表達異常HLA-Ⅰ類的細胞,可能在固體器官移植中起到以前未被認知的作用。NK細胞作為產(chǎn)生先天性免疫的一部分,成為抵御外來抗原的第一線。它們不需要啟動,就能獨立殺傷靶細胞。NK細胞活性高峰出現(xiàn)在反應(yīng)起始3天內(nèi),在T細胞活性成熟之前。已經(jīng)確知,NK細胞有抗腫瘤,病毒感染,和抗骨隨移植排斥反應(yīng)作用。現(xiàn)在,在同種異體移植的動物模型已經(jīng)證明了NK細胞在固體器官移植中的重要性。在人體,已經(jīng)證明腎同種異體移植物發(fā)生急性排斥反應(yīng)時血

3、循環(huán)中NK細胞數(shù)增加,并有浸潤心臟和腎臟移植物現(xiàn)象。在活體外顯示NK細胞能夠溶解人類腎臟上皮細胞。使用一種定向不同白細胞標記的單克隆抗體面板,顯示CD56+NK細胞緊隨T細胞和巨噬細胞后,在早期排斥反應(yīng)中浸潤腎移植物。
　　 自然殺傷(NK)細胞通過殺傷細胞免疫球蛋白受體(KIR)與自身主要組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅰ類分子結(jié)合來防止殺傷自體細胞。KIR是研究最多的控制NK細胞功能的刺激性和抑制型受體群體。KIR基因座位編碼在常

4、染色19q13.4,為跨膜糖蛋白,其胞外有兩個或三個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域,分別為KIR2D和KIR3D。根據(jù)胞漿結(jié)構(gòu)域的不同KIR可分為L(抑制型)受體控制NK細胞功能的抑制效應(yīng)和S(激活型)受體控制NK細胞功能的激活效應(yīng)；抑制型KIR的胞漿結(jié)構(gòu)域比較長,如KIR3DL1有三個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和含有ITIM抑制基序列；而激活型KIR的胞漿結(jié)構(gòu)域相對比較短,如KIR3DS1,其跨膜區(qū)還含有能與特異性接頭蛋白相結(jié)合的帶有正電荷的殘基,不含I

5、TIM序列。每種人類NK細胞可表達數(shù)種KIR。KIR通過它們胞質(zhì)尾區(qū)的特異性基序(免疫調(diào)節(jié)的酪氨酸抑制基序[ITIM])補充磷酸酯酶,以防止細胞活化引起的磷酸化。然而,一些缺乏ITIM基序的分子亞型,通過與一些連接分子相聯(lián)系能夠刺激細胞的功能。這些連接分子包含有起效應(yīng)機制必須的活性基序(ITAM)。
　　 NK細胞活性可能是激活與抑制受體間平衡的結(jié)果。正常情況下,抑制性信號抵消了刺激性信號從而防止了殺傷自體細胞,從而避免了自身免

6、疫。然而,腫瘤細胞和病毒感染的細胞MHC Ⅰ類分子已經(jīng)改變或低水平表達,導(dǎo)致因缺乏抑制性信號而致的NK細胞毒性。我們假設(shè)如果MHC Ⅰ類分子不被受體的抑制性受體識別,那么NK細胞將會殺傷同種細胞。自然殺傷細胞免疫球蛋白受體(KIR)--最有代表性的NK細胞受體群組,有同種異型和同型性的特性。舉個例,KIR2DL1僅與人類白細胞抗原2(HLA-2)-Cw(Ser77,Asn80)相關(guān)聯(lián),而KIR2DL2僅與1類HLA-Cw(Asn77,L

7、ys80)分子相關(guān)聯(lián)。因此,HLA分子錯配的同種異體移植物可被識別和殺傷。因錯配的同種異體移植物不表達受者的MHC Ⅰ類分子,因此成為NK細胞潛在殺傷目標。在我們現(xiàn)有的相關(guān)(親屬)-不相關(guān)(非親屬)腎移植方案中,供受者HLA和KIR基因有很大不同。這給我們提供了剖析KIR在移植后NK細胞效應(yīng)中的影響的一個獨特機會。本文意在對尿毒癥患者這一特殊人群(潛在腎臟移植受體)的KIR基因頻率進行研究,了解KIR基因在這類人群中的表達分布,分析其K

8、IR基因頻率分布規(guī)律以及與疾病間的關(guān)聯(lián)。
　　 目的:調(diào)查人類自然殺傷(NK)細胞表面免疫球蛋白樣受體(KIR)在尿毒癥患者中的表達。
　　 方法:選擇102例等候腎臟移植的尿毒癥患者,抽取靜脈血。根據(jù)2006年11月10日IDP KIR序列數(shù)據(jù)庫(www.ebi.ac.uk/ipd/kir)公布的KIR堿基編碼序列(release 1.3.0),共設(shè)計23對上下游引物序列均經(jīng)過BLAST軟件驗證,可識別16個KIR基因

9、,包括14個功能基因和2個沉默基因。測定DNA濃度和純度,采用聚合酶鏈式反應(yīng)序列特異引物分型技術(shù)(polymerase chainrecation-sequences specific primer,PCR-SSP),檢測102例等候腎臟移植的尿毒癥患者的KIR基因頻率并與已發(fā)表的其他國家及地區(qū)華人及東亞鄰國韓國、日本人群的KIR基因頻率進行比較。
　　 結(jié)果:表達16個KIR基因,其中KIR-3DL2、3DL3、3DP1基因頻

10、率為1.00；2DL1、2DL3、2DL4、3DL1的基因頻率在0.73～0.90之間；2DS4、2DP1的基因頻率在0.61～0.69之間:2DL2、2DL5、2DS1、2DS2、2DS3、2DS5、3DS1的基因頻率在0.10～0.22之間。結(jié)果與其他華人為主的國家和地區(qū)以及亞洲其他健康人群做比較,14個KIR功能基因的基因頻率與中國香港人群基本吻合；除2DL3(P=0.09)外,13個KIR基因與新加坡華人之間的基因頻率差異<0.

11、20,本文檢測到KIR-2DL2、2DL3和2DS2的基因頻率與韓國人、日本人群之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論:102例受調(diào)查者普遍帶有框架基因3DL2、3DL3、3DP1,其次為2DL1、2DL3、2DL4、3DL1、2DS4,較罕見為2DS3、2DL2、2DS1、2DS2、2DS3和2DS5；本研究顯示尿毒癥患者KIR-2DL3表達頻率低于其他健康人群,且尿毒癥患者KIR基因多態(tài)性與其他非華人種族人群之間