殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體基因金態(tài)性與Graves病關(guān)聯(lián)性的研究.pdf

1、背景:Graves病(Gravesdisease，GD)是一種伴甲狀腺激素(Thyroidhormone，TH)分泌增多的器官特異性自身免疫性疾病，臨床上以高代謝癥候群、甲狀腺彌漫性腫大、Graves眼病(Gravesophthalmopathy,GO)和脛前黏液水腫為特點(diǎn)。Graves病是引起甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)最常見的原因，近年發(fā)病率逐年升高，在女性患病率為2％～4％，男性約1％，并存在發(fā)病年輕化趨勢，嚴(yán)重危害人民群眾的健康。
　　

2、Graves病發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但目前公認(rèn)，它以遺傳易感性為背景，在感染、毒素、藥物等啟動(dòng)因素的作用下，引起體內(nèi)免疫功能紊亂。研究認(rèn)為Ts細(xì)胞功能缺陷，減弱了對Th細(xì)胞的抑制，后者輔助特異B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生異質(zhì)性TSH受體抗體（Thyroidhormonereceptorantibodies，TRAb）。該抗體與TSHR(Thyroid-stimulatinghormonereceptor)的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合，引起甲狀腺增生，合成并釋放大

3、量甲狀腺激素。其中T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞及多種細(xì)胞因子作為免疫調(diào)節(jié)劑、免疫效應(yīng)分子等均參與到這一過程，對疾病的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后起重要作用。
　　自然殺傷細(xì)胞(naturalkillercell，NKcell)是不同于T、B細(xì)胞、具有直接殺傷靶細(xì)胞效應(yīng)的一類淋巴細(xì)胞，同時(shí)具有抗腫瘤、抗感染、免疫調(diào)節(jié)等功能，并參與移植排斥反應(yīng)及自身免疫性疾病的發(fā)生。NK細(xì)胞功能主要受其表面活化性和抑制性受體的調(diào)控，當(dāng)這兩種受體的平衡異常時(shí)，NK細(xì)胞就會(huì)

4、表現(xiàn)出異常的殺傷和免疫調(diào)節(jié)活性。近年NK細(xì)胞在Graves病中的作用頗受關(guān)注，研究認(rèn)為存在NK細(xì)胞數(shù)量、活性及細(xì)胞因子分泌等的異常。
　　殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killercellimmnoglobulin-likereceptor,KIR)屬于免疫球蛋白超家族（Ig-superfamily,Ig-SF），表達(dá)于NK細(xì)胞和部分T細(xì)胞表面，是繼HLA后發(fā)現(xiàn)的具有高度多樣性的免疫調(diào)節(jié)基因家族。它特異性識(shí)別靶細(xì)胞表面的MHCⅠ類分子

5、，傳導(dǎo)激活或抑制信號(hào)，參與機(jī)體先天性和獲得性免疫應(yīng)答。KIR根據(jù)功能分為抑制性和活化性兩類受體。人KIR基因位于19號(hào)染色體的白細(xì)胞受體復(fù)合體(leukocytereceptorcomplex，LRC)內(nèi)，迄今發(fā)現(xiàn)14個(gè)KIR基因和2個(gè)假基因。KIR基因呈高度的多態(tài)性（highdiversity），除等位基因多態(tài)性外，還包括單倍型(haplotype)組成基因的多樣性，表基因型多樣性，即同一個(gè)體的不同T、NK細(xì)胞克隆表達(dá)的KIR不同。K

6、IR基因高度多態(tài)性構(gòu)成了不同個(gè)體和種族間疾病易感性和免疫應(yīng)答差異的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)GD患者的KIR2DS4基因頻率顯著低于對照組，推測KIR2DS4基因是GD發(fā)病的保護(hù)基因。
　　目的:對Graves病患者免疫調(diào)節(jié)基因KIR、HLA進(jìn)行分析，探討KIR-HLA受體配體組合多樣性與Graves病是否存在關(guān)聯(lián)性;對KIR2DS4(CD158i)分子在NK細(xì)胞上的表達(dá)譜進(jìn)行分析，研究KIR2DS4在表達(dá)水平與Graves病的

7、關(guān)聯(lián)性。同時(shí)測定NK細(xì)胞百分比及殺傷活性，探討NK細(xì)胞在Graves病中的作用機(jī)制。
　　方法:1.選取100名Graves病患者和86名年齡、性別相配比的健康對照，應(yīng)用PCR/SSP的方法，對KIR基因家族的5個(gè)KIR基因(包括KIR2DL1，KIR2DS1，KIR2DL2，KIR2DS2，KIR2DL4)進(jìn)行擴(kuò)增（除KIR2DL4基因外，每個(gè)基因均應(yīng)用2對不同的序列特異性引物），并用PCR/SSP法測定兩組KIR-HLA-Cw

8、受體配體組合與Graves病的相關(guān)性。
　　2.選取95名Graves病患者和83名年齡、性別相配比的健康對照，應(yīng)用流式細(xì)胞檢測的方法，對Graves病的保護(hù)基因KIR2DS4在NK細(xì)胞上的表達(dá)進(jìn)行測定，研究KIR在表達(dá)水平與Graves病的關(guān)聯(lián)性。
　　3.收集GD組與健康對照組外周血免疫細(xì)胞分型的臨床數(shù)據(jù)，探討T細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞在GD中的作用機(jī)制。
　　4.應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)，采用特異性抗體，檢測方法2中兩組外周血

9、NK細(xì)胞表面分子，包括CD3，CD56和CD69，測定NK細(xì)胞百分比及活性，進(jìn)一步探討NK細(xì)胞在GD中的作用機(jī)制。
　　結(jié)果:1.GD組與對照組HLA-Cw基因頻率分布的比較:GD患者HLA-Cw01基因頻率高于對照組(p＜0.05)，HLA-Cw03與HLA-Cw06基因頻率低于對照組(p＜0.01)。
　　2.GD組與對照組KIR-HLA受體配體對的比較:GD患者
　　KIR2DL1(+)HLA-CwLys(+)(

10、p＜0.05)和KIR2DS1(+)HLA-CwLys(+)(p＜0.05)的陽性率較對照組顯著降低。
　　3.GD組與對照組KIR2DS4在NK細(xì)胞上表達(dá)的比較:GD組(76.84％)低于對照組(84.34％)，但無顯著性差異;
　　4.臨床數(shù)據(jù)分析顯示，GD組較對照組CD8+T細(xì)胞比例顯著降低(24.430％±6.332％vs28.497％±6.390％)，CD4/8比值升高(1.673±0.590vs1.393±0.4

11、80)，NK細(xì)胞百分比降低(10.541％±9.067％vs18.258％±7.490％)，以上比較p＜0.05。
　　5.GD組與對照組NK細(xì)胞百分比及活性的比較:GD患者的NK細(xì)胞百分比(p＜0.01)及活性(p＜0.01)較對照組顯著降低。初步分析GD組NK細(xì)胞活性與KIR2DS4表達(dá)無相關(guān)性。
　　結(jié)論:1.GD患者中抑制性KIR2DL1和活化性KIR2DS1與其配體HLA-CwLys的組合頻率均低于正常人群，說明K

12、IR-HLA配對多樣性與GD相關(guān)。
　　2.NK細(xì)胞表面KIR2DS4的表達(dá)陽性率GD患者低于正常人群，但未達(dá)到顯著性差異，說明KIR2DS4在表達(dá)水平與基因水平存在差異，基因水平存在的差異在表達(dá)水平消失，影響表達(dá)的具體因素尚不明確。
　　3.GD患者中CD8+降低以及CD4/8升高，提示CD4+T細(xì)胞占優(yōu)勢，可能與TRAb產(chǎn)生有關(guān)。CD4/8比值升高，輔助性與抑制性T淋巴細(xì)胞失衡，導(dǎo)致抑制性T淋巴細(xì)胞對自身抗原特異性Th細(xì)