核苷酸切除修復(fù)基因多態(tài)性與卵巢癌鉑類藥物耐藥相關(guān)性研究.pdf

1、目的：腫瘤細(xì)胞對鉑類藥物的化療敏感性與個體的DNA損傷修復(fù)能力關(guān)系密切，ERCC1、XPA、XPC、XPD、XPG基因是核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)(NER)中與鉑類藥物抵抗有關(guān)的關(guān)鍵因子，本實驗擬篩查ERCC1、XPA、XPC、XPD、XPG遺傳多態(tài)與卵巢癌耐鉑類藥物的細(xì)胞株的關(guān)系，為下一步實驗打下基礎(chǔ)；研究核苷酸切除修復(fù)基因XPG單核苷酸多態(tài)性與卵巢癌患者對鉑類藥物敏感性的關(guān)系；通過構(gòu)建人XPG基因的shRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染卵巢癌SKOV3耐

2、DDP細(xì)胞，檢測其對XPG基因的干擾效率。 方法：應(yīng)用PCR及測序方法篩查ERCC1、XPA、XPC、XPD、XPG外顯子單核苷酸多態(tài)性在卵巢癌耐鉑類藥物的細(xì)胞株和敏感細(xì)胞株中的分布差異，序列讀解采用ChromaS軟件，并結(jié)合NCBISNP數(shù)據(jù)庫尋找和驗證SNP位點，篩選出的SNP用于下一步實驗；對接受含鉑類藥物化療的102例晚期卵巢癌患者進(jìn)行臨床療效評價。以聚合酶鏈-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)的方法檢測接受含鉑類

3、藥物化療的102例卵巢癌患者XPGHis46His及XPG His1104Asp的多態(tài)基因型，并比較不同基因型與化療敏感性的關(guān)系；針對XPG mRNA的不同區(qū)域構(gòu)建了不同的siRNA載體，應(yīng)用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染SKOV3耐DDP細(xì)胞，實時定量PCR檢驗干擾效率，選擇抑制率最高的siRNA構(gòu)建shRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染SKOV3耐DDP細(xì)胞，G418篩選后經(jīng)western-blot鑒定確認(rèn)獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SKOV3耐DDP細(xì)胞株，然后進(jìn)行細(xì)胞生長特

4、性、細(xì)胞周期變化、細(xì)胞藥敏試驗及細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的實驗。 結(jié)果：DNA測序分析發(fā)現(xiàn)XPGHis46His及XPGHis1104Asp兩個SNP位點在細(xì)胞株中存在分布差異；His1104Asp多態(tài)在卵巢癌鉑類藥物化療敏感組中分布與耐藥組差異不顯著。XPGHis46His在化療敏感組T/T，T/C，C/C的基因型頻率明顯高于耐藥組，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p=0.016)，與攜帶XPG46T/T基因型比較，攜帶至少一個46C等位基因(即

5、T/C和C/C基因型)的卵巢癌患者對鉑類藥物化療敏感可能性增加3.096倍(95％CI:1.330-7.208)。XPG His46His及His1104Asp基因多態(tài)與臨床病理特征之間的比較差異無顯著意義(P>0.05)。T/T基因型組生存期短于T/C+C/C基因型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)； COX風(fēng)險比例回歸模型結(jié)果顯示病理分級是卵巢癌患者的獨立預(yù)后因素(P<0.05)；實驗組與陰性對照組的IC50差別有均統(tǒng)計學(xué)意義(P

6、<0.05)，經(jīng)化療藥處理后，用高效液相色譜儀檢測其細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，實驗組細(xì)胞內(nèi)藥物濃度低于對照組細(xì)胞(P<0.05)。 結(jié)論：核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)中XPGHis46His及XPGHis1104Asp遺傳多態(tài)可能與卵巢癌患者對鉑類藥物耐藥性相關(guān)；核苷酸切除修復(fù)系統(tǒng)中XPGHis46His遺傳多態(tài)可能與卵巢癌患者對鉑類藥物敏感性相關(guān)；采用構(gòu)建shRNA表達(dá)載體對XPG基因進(jìn)行干擾，SKOV3耐DDP細(xì)胞的生長特性、細(xì)胞周期無明顯變化