BMFD-AM接觸鏡聯合人表皮干細胞重建兔角膜上皮.pdf

1、目的： 利用眼表生物膜固定裝置(BMFD)固定羊膜(AM)制成的BMFD—AM接觸鏡在角膜緣干細胞缺損(limbal stem cell deficiency，LSCD)兔眼表注射人表皮干細胞(Epi—SCs)單細胞懸液，觀察并評價其重建角膜上皮的可行性、有效性和安全性。 方法： 1.人表皮干細胞(Epi—SCs)的體外培養(yǎng)、純化以及鑒定：取正常男性供體新鮮皮膚組織，采用消化法和Ⅳ型膠原黏附法獲得并分選人表皮干細

2、胞，體外原代培養(yǎng)。 2.原瓶粘附分選法獲得20 min快吸附的表皮干細胞，制備濃縮的人表皮干細胞懸液(×107/ml)。利用激光共聚焦顯微鏡(Laser scanning confocal microscope，LSCM)用免疫細胞熒光的方法從細胞水平檢測K10、K19、K15的表達，鑒定篩選所得的人表皮干細胞。 3.用機械刮除法制作雌性新西蘭兔角膜上皮及角膜緣干細胞缺損動物模型(n=60)并隨機分為3組，每組20只：

3、 BMFD—AM+ Epi—SCs組：利用眼表生物膜固定裝置(BMFD)固定羊膜(AM)制成的BMFD—AM接觸鏡聯合表皮干細胞單細胞懸液注射行眼表干細胞移植； BMFD—AM組：行BMFD—AM接觸鏡治療； 空白對照組：單純藥物滴眼治療。 4.術后局部滴含雙抗的表皮細胞培養(yǎng)液4-6次/日，0.15％環(huán)孢素A眼液2次/日，每晚結膜囊涂貝復舒(bFGF)眼膏。每3日更換羊膜，直至角膜完全上皮化。每日裂隙燈

4、下觀察角膜上皮修復、角膜透明度、新生血管、炎癥反應等并評分，隨訪約2周。 5.病理組織及免疫組織化學檢查：手術后當天，1天，3天、1周、2周，分別取材進行冰凍切片，行HE染色和免疫組織化學染色(P63、K1/10、K3/12、K4、Pax6、MUC5AC) 6.Y—STR基因檢測：術后2周標本行Y—STR基因檢測。 7.數據采用SPSS for Windows11.5統(tǒng)計軟件處理，統(tǒng)計學方法為配對t檢驗和單因素方

5、差分析，以P<0.05具有統(tǒng)計學顯著性差異。 結果： 1、成功在體外無血清無飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系下擴增原代人表皮干細胞，細胞呈球形體積小，核質比高、細胞器少，細胞在顯微鏡下折光性強，胞體透亮。 2、Ⅳ型膠原黏附法聯合原瓶黏附分選法篩選得到的表皮干細胞呈K15和K19陽性，K1/K10陰性，并具有較強的增殖能力，傳代后7天見細胞生長致密，體積較小，核漿比例較大。 3、BMFD—AM+ Epi—SCs組角膜上皮修復

6、快，平均(5.60±0.46)d達到完全上皮化，而另外兩組角膜上皮修復遲緩，完全上皮化時間為：BMFD—AM組(9.25±0.51)d，空白對照組(12.45±0.65)d，各組間均有明顯統(tǒng)計學差異(P<0.05)。在角膜完全上皮化當日，角膜混濁程度評分(x±s)：BMFD—AM+Epi—SCs組0.45±0.11；BMFD—AM組1.70±0.21；空白對照組2.85±0.20，各組間均有明顯統(tǒng)計學差異(P<0.05)。新生血管評分：

7、BMFD—AM+ Epi—SCs組0.75±0.16：BMFD—AM組2.40±0.23；空白對照組2.65±0.17。BMFD—AM+Epi—SCs組與BMFD—AM組及空白對照組間均有明顯統(tǒng)計學差異(P<0.05)，而單純羊膜治療組及對照組間無統(tǒng)計學差異。 4、組織病理學(HE染色)顯示細胞移植治療后角膜上皮逐漸恢復正常復層結構。對照組上皮結膜化，出現杯狀細胞，角膜基質膠原纖維增殖，新生血管增生，炎癥細胞浸潤。 5、

8、免疫組化染色顯示細胞移植后的角膜區(qū)域上皮K3/K12(+)、K4(—)，MUC5AC(—)，K1/K10(—)，表明是角膜上皮表型，而兩對照組角膜區(qū)域上皮MUC5AC(+)、K4(+)、K3/K12(—)，為結膜上皮表型。 6、移植男性人表皮干細胞的雌兔角膜完全上皮化后，PCR檢測到男性Y—STR基因12個位點。 結論： 表皮干細胞是重建角膜上皮的理想種子細胞。BMFD—AM接觸鏡聯合注射人表皮干細胞單細胞懸液在