可溶性mB7-H4對Con A誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護(hù)作用.pdf

1、[目的] 在機(jī)體的免疫應(yīng)答過程中，B7-H4作為重要的共刺激分子，為T、B細(xì)胞的激活提供了重要的共刺激信號?；罨腡細(xì)胞產(chǎn)生以IL-10、IL-2、IL-12、FNF-α、γ-干擾素(IFN-γ)為主的細(xì)胞因子介導(dǎo)對肝細(xì)胞的免疫性損傷成為病毒性肝炎的主要致病機(jī)理。研究人員發(fā)現(xiàn)B7-H4分子在自身免疫性疾病中對T細(xì)胞的活化發(fā)揮著一定的負(fù)性調(diào)控作用，它能抑制CD4+T細(xì)胞的活化、增殖，阻止細(xì)胞周期在G0/G1期。但是，B7-H4分子

2、對T細(xì)胞免疫應(yīng)答進(jìn)行的精細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。 本文采用Con A誘導(dǎo)性肝損傷小鼠模型進(jìn)行可溶性mB7-H4蛋白干預(yù)實驗，以探討可溶性mB7-H4蛋白是否對肝臟的免疫性損傷具有保護(hù)作用及其作用機(jī)制。 本研究將流體動力法(Hydrodynamies-based procedure)應(yīng)用于小鼠可溶性mB7-H4蛋白的體內(nèi)表達(dá)，成功地將pcDNA3.1/mB7-H4-Fc表達(dá)載體導(dǎo)入了小鼠肝臟，獲得了重組pcDNA3.1

3、/mB7-H4-Fc在肝內(nèi)的高效穩(wěn)定表達(dá)。通過可溶性mB7-H4蛋白對Con A致肝臟免疫性損傷的干預(yù)實驗初步表明，可溶性mB7-H4蛋白對Con A導(dǎo)致的T細(xì)胞介導(dǎo)的肝臟免疫性損傷具有保護(hù)作用。這一發(fā)現(xiàn)為可溶性mB7-H4蛋白在病毒性肝炎臨床防治方面的研究提供了重要的理論依據(jù)。 [方法] 1.可溶性mB7-H4蛋白的表達(dá)與純化 (1)將構(gòu)建好的原核表達(dá)質(zhì)粒pET/mB7-H4，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5 α進(jìn)行

4、保種，轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)，進(jìn)行可溶性蛋白mB7-H4的表達(dá)。 (2)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，進(jìn)行時間和溫度的定位，確定最佳表達(dá)時間，最佳表達(dá)溫度和最佳IPTG濃度。 (3)采用Ni-NTA親和層析方法，在變性條件下，給予大量表達(dá)mB7-H4蛋白以純化。然后，通過尿素梯度復(fù)性方法，獲得大量可溶性mB7-H4蛋白。 (4)復(fù)性后的可溶性mB7-H4蛋白，經(jīng)去除內(nèi)毒素處理，用于Con A誘導(dǎo)小鼠肝損傷的治療

5、。 2.pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠體內(nèi)表達(dá) (1)采用即時RT-PCR的方法，定量檢測pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠體內(nèi)的表達(dá)。 (2)建立可溶性融合蛋白mB7-H4-hIg的ELISA檢測方法，定量檢測pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠體的內(nèi)表達(dá)。 3.可溶性mB7-H4蛋白對Con A誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護(hù)作用 (1)檢測血清ALT和AST，觀察分析可溶性mB

6、7-H4蛋白對Con A誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護(hù)作用。 (2)肝組織病理切片，判斷可溶性mB7-H4蛋白對Con A誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護(hù)作用。 (3)檢測血清IL-4和IFN-γ，觀察分析可溶性mB7-H4蛋白對Con A誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護(hù)作用。 [結(jié)果] 1.可溶性蛋白mB7-H4的表達(dá)與純化pET/mB7-H4導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生包涵體mB7-H4蛋白。包涵體經(jīng)過洗

7、滌、復(fù)性、透析、親和層析和去除內(nèi)毒素后，獲得可溶性mB7-H4蛋白，純度在90％以上。 2.pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠體內(nèi)表達(dá) (1)即時定量RT-PCR結(jié)果表明，pmB7-H4-Fc經(jīng)小鼠尾靜脈注射，能夠穩(wěn)定地表達(dá)，量在48小時達(dá)到最高。 (2)采用ELIsA技術(shù)，定量檢測小鼠可溶性融合蛋白mB7-H4-hIg,結(jié)果表明，經(jīng)尾靜脈注射的pcDNA3.1/mB7-H4-Fc，能在肝組織中穩(wěn)定表達(dá)，

8、48小時分泌的量達(dá)到最高值，即120ng/ml。 3.可溶性mB7-H4蛋白對Con A誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護(hù)作用 (1)小鼠血清ALI和AST 在注射Con A后，各組小鼠血清ALT和AST水平較正常水平均有明顯升高，達(dá)注射前的3～5倍。表達(dá)載體組和蛋白組ALT和AST值均明顯低于陽性對照組和/或空載體組。表達(dá)載體組與陽性對照組間血清ALT和AST濃度，經(jīng)方差分析：①Falt=9668，p=0.004；Fast=12.3

9、68，p=0.002(質(zhì)粒組)；②Falt=12.394，p=0.001；Fast=6.422，p=0.016(蛋白組)。表達(dá)載體組與陽性對照組間血清ALT和AST濃度比較，具有顯著性差異。結(jié)果表明，可溶性mB7-H4蛋白在Con A誘導(dǎo)小鼠肝損傷中能減輕Con A帶來的損傷，具有保護(hù)作用。 (2)肝組織病理切片在注射Con A后，Con A組和空載體組肝細(xì)胞即出現(xiàn)變性改變，肝細(xì)胞腫脹、胞漿疏松、細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整、肝竇內(nèi)紅細(xì)胞淤積

10、，門靜脈區(qū)和中央靜脈區(qū)可見大量淋巴細(xì)胞、多葉核粒細(xì)胞浸潤，胞核破損，胞漿出現(xiàn)囊性或空泡樣改變。相比之下，表達(dá)載體組以及蛋白組的小鼠在注射Con A后，其肝臟的損傷比較輕，匯管區(qū)可見少量淋巴細(xì)胞浸潤，有些細(xì)胞胞漿出現(xiàn)了空泡樣改變，但胞核完整，肝臟內(nèi)未見壞死區(qū)。結(jié)果表明，可溶性mB7-H4蛋白在Con A誘導(dǎo)小鼠肝損傷中，能減輕Con A帶來的損傷，具有保護(hù)作用。 (3)小鼠血清IL-4和IFN-γ在注射Con A后，各組小鼠血清I

11、L-4和IFN-γ水平較正常水平均有明顯升高，達(dá)正常值的5～10倍。表達(dá)載體組和蛋白組IL-4和IFN-γ值明顯低于陽性對照組和/或空載體組。表達(dá)載體組與陽性對照組間血清IFN-γ濃度，經(jīng)方差分析：①Falt=13.728，p=0.001；Fast=22.250，p<0.0001(質(zhì)粒組)；②Falt=20.6456，p<0.0001；Fast=10.573，p=0.002(蛋白組)。表達(dá)載體組與陽性對照組間血清IL-4和IFN-γ濃度