誘導重癥肌無力模型新方法并研究可溶性促衰變因子對其的保護作用.pdf

1、因實驗性自身免疫重癥肌無力（EAMG)動物模型其發(fā)病特點與重癥肌無力(MG)患者相似,故一直以來成為 MG病因病理及治療研究的媒介,也正是有了EAMG,使得MG的研究取得了突飛猛進的發(fā)展。常用的誘導EAMG模型的方法有主動免疫和被動免疫。以往學者通常用MG患者血清被動免疫EAMG,用人肌肉乙酰膽堿受體(AChR)或電鰩電器官中的AChR作為免疫原主動免疫EAMG。但與被動免疫相比,主動免疫的EAMG其T、B細胞免疫反應特點更符合MG發(fā)病

2、特點,所以大多數(shù)研究仍采用主動免疫來制備 EAMG。但是電鰩獲取不易且價格昂貴,提取過程中需使用α-銀環(huán)蛇毒等昂貴的試劑,給EAMG的制作增加了難度;而人肌肉獲取也相對不易,且肌肉中的AChR一旦離體便會很快降解,而且提取量也較少,所以需要尋找一種便捷的方法誘導EAMG。
　　既然天然的AChR不易獲得,那么我們可以人工合成獲取AChR去免疫動物。若取AChR全長序列表達蛋白,蛋白分子量大,給基因表達、轉化和蛋白表達技術操作上帶來

3、很多不便,特別是會發(fā)生基因突變造成表達的蛋白不具有抗原性。
　　參照研究發(fā)現(xiàn)針對AChR的自身抗體(Ab)在MG發(fā)生上起了決定性作用,而其抗體的產生主要是針對AChRα亞基N末端胞外域ECD(α1-210)的。因為在ECD上有主要免疫原區(qū)(MIR)和特異性T細胞、B細胞表位,還有AChR結合位點。當自身抗體產生后與ECD上AChR結合位點結合,使AChR失活,同時刺激特異性T細胞增殖,補體系統(tǒng)激活,最終引發(fā)MG發(fā)生。所以在EAMG

4、模型制備中,可以考慮用該片段誘導動物。
　　研究發(fā)現(xiàn)起源于人神經髓母細胞瘤的TE671細胞中的AChR(AChRTE)也能夠和人肌肉AChR(AChRMU)單克隆抗體(mAbs)發(fā)生反應,包括針對AChR ECD區(qū)和MIR區(qū)的mAbs。所以用AChRTE重組表達AChRMUα亞基ECD蛋白是可行的。本實驗充分采用了如RT-PCR,載體構建、轉化,蛋白在大腸桿菌中的表達,液相色譜等技術得到了高度純化的ECD蛋白,并免疫Lewis大鼠

5、制作EAMG。再將純化提取的大鼠可溶性促衰變因子(rDAF)靜脈注射入EAMG模型中,評估其在血漿中代謝情況,研究其對MG的保護作用。
　　實驗結果經測序證明PCR克隆出的ECD核苷酸序列,同人類基因庫中的完全一致,成功插入到載體pET16b后,用IPTG誘導表達蛋白。之后用SDS-PAGE法印證了得到的包涵體蛋白正是目的蛋白。經透析復性后,ECD蛋白能夠和mAb35結合,證明蛋白具有活性。將得到的可溶性ECD蛋白免疫大鼠,得到了