小鼠IFN-ε的可溶性表達(dá)及其對(duì)絕經(jīng)后泌尿系感染的作用.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建小鼠IFN-ε蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)和純化后獲得穩(wěn)定的可溶性重組蛋白并驗(yàn)證其生物學(xué)活性。建立絕經(jīng)后泌尿系感染的小鼠模型，觀察IFN-ε對(duì)其治療作用。
　　方法：
　　1.將目的基因克隆到表達(dá)載體pET28a-SUMO，和能同時(shí)表達(dá)三個(gè)分子伴侶groES、groEL和tig的質(zhì)粒pG-tf2一起轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)，用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IP TG)誘導(dǎo)表達(dá)。通過Ni-

2、NTA親和層析柱、Desalting柱、Q-HP柱及Superdex75分子篩層析經(jīng)行純化后，用Ulp1酶切，并對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析。對(duì)目標(biāo)蛋白抑制腫瘤細(xì)胞增長活性，刺激細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白的活性進(jìn)行了鑒定。
　　2.選取ICR雌性健康小鼠分為兩組，去勢組和假手術(shù)組，并通過雌激素測定、陰道涂片的方法驗(yàn)證去勢效果。用50μ1UPEC對(duì)去勢小鼠進(jìn)行膀胱灌注，建立絕經(jīng)后泌尿系感染的小鼠模型，24小時(shí)后處死小鼠，收集膀胱和尿液標(biāo)本，將膀胱

3、分為兩部分，一部分和尿液標(biāo)本一起進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，另一部分常規(guī)病理切片，觀察結(jié)果。按照上述方法建立絕經(jīng)后泌尿系感染小鼠模型，分為去勢感染組和去勢感染治療組，治療組分別在模型制作后的第一天、第四天和第七天灌注小鼠IFN-ε（0.8mg/ml，50μl），最后一次灌注結(jié)束24小時(shí)后處死小鼠，收集其尿液和膀胱標(biāo)本，膀胱標(biāo)本分為兩部分，一部分ELISA檢測炎癥因子，另一部分常規(guī)病理切片。觀察小鼠IFN-ε對(duì)絕經(jīng)后泌尿系感染的治療作用。
　　結(jié)

4、果：
　　1.成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a-SUMO-IFN-ε，和分子伴侶共表達(dá)獲得較多可溶性蛋白。目標(biāo)蛋白酶切后仍可溶，SDS-PAGE分析顯示重組IFN-ε蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為22000。質(zhì)譜分析證實(shí)目標(biāo)蛋白的序列和小鼠IFN-ε的序列吻合。小鼠IFN-ε能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長并能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白MxA。
　　2.成功制作絕經(jīng)泌尿系感染小鼠模型。小鼠IFN-ε對(duì)于絕經(jīng)后泌尿系感染的小鼠膀胱組織中的炎性因子IL-5