凝血酶敏感蛋白—1對人肝癌細(xì)胞株HCCLM3的作用及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、一研究背景與目的：肝細(xì)胞癌(HepatocellulorrCarcinoma，HCC)是我國發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，目前采取手術(shù)切除為主的綜合治療，但是療效仍不十分理想，嚴(yán)重威脅人們的健康和生命。肝細(xì)胞癌具有進(jìn)展較快、易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、預(yù)后較差的特點(diǎn)。肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是在多因素影響下的一個(gè)多步驟、多階段的復(fù)雜過程，對其發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的尚未明確。凝血酶敏感蛋白(Thrombospondin，TSP)是一組多功能糖蛋白，TSP-1

2、是其中最重要的成員，可被多種細(xì)胞合成并分泌至細(xì)胞外基質(zhì)中，與細(xì)胞表面的受體相互作用而發(fā)揮多種生理功能，近年來發(fā)現(xiàn)TSP-1可被多種腫瘤細(xì)胞合成分泌，在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、粘附、遷移等生物學(xué)行為和腫瘤的新生血管形成中發(fā)揮重要作用。已有研究證實(shí)在其他腫瘤中TSP-1的合成及分泌的變化與腫瘤的進(jìn)展有密切關(guān)系。但是TSP-1對肝癌的作用尚未見報(bào)道，本文通過一系列實(shí)驗(yàn)探討TSP-1對肝癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響，初步研究其作用機(jī)制，并在裸鼠移植瘤的

3、試驗(yàn)中給予驗(yàn)證。 二試驗(yàn)方法 1TSP-1、CD36、CD47在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)及人肝癌細(xì)胞株的選擇： 用Westernblot方法檢測人肝癌細(xì)胞株HCCLM3、MHCC97，HepG2、SMMC-7721細(xì)胞株中TSP-1及其受體CD36，CD47蛋白的表達(dá)，選擇TSP-1陰性表達(dá)或者低表達(dá)，并且表達(dá)其受體CD36，CD47的細(xì)胞株作為研究對象。 (1)用MTT方法檢測TSP-1及其受體CD36、CD

4、47對細(xì)胞生長的作用。 (2)MTT法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測TSP-1及其受體CD36、CD47對細(xì)胞粘附力的作用。 (3)流式細(xì)胞術(shù)檢測TSP-1及其受體CD36、CD47對細(xì)胞周期和凋亡的作用。 (4)透射電子顯微鏡觀察TSP-1及其受體CD36、CD47對細(xì)胞凋亡的影響及超微結(jié)構(gòu)的變化。 (5)采用Boyden小室的方法檢測TSP-1及其受體CD36、CD47對細(xì)胞體外侵襲、遷移能力的影響。 5T

5、SP-1及其受體CD36、CD47對人肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響機(jī)制的初步研究： (1)用ELISA法檢測TSP-1及其受體對CD36、CD47對細(xì)胞株TGF-Betal分泌的影響，從而研究TSP-1對細(xì)胞株生長影響可能的途徑。 (2)用RT-PCR法檢測TSP-1及其受體對CD36、CD47對細(xì)胞株Caspase3和MMP-9表達(dá)的影響，分析TSP-1對細(xì)胞株凋亡及體外侵襲、遷移能力可能的作用通路。 6TSP-1對

6、裸鼠種植瘤作用的研究 對數(shù)期生長的細(xì)胞以每只0.2ml(5×106)接種于4-6周齡的Balb/c裸鼠的背部，待腫瘤全部長出后隨機(jī)分為對照組和試驗(yàn)組(n=6)，試驗(yàn)組隔日按40mg/kg的劑量皮下注射TSP-1，對照組相同的方法注射生理鹽水。治療三周后處死裸鼠，測量裸鼠種植瘤的體積、重量。將腫瘤標(biāo)本10％的中性福爾馬林固定石蠟包埋，用免疫組織化學(xué)方法檢測CD34標(biāo)記的微血管密度。分析TSP-1對裸鼠種植瘤體積、重量及血管生成的影

7、響。 三結(jié)果 1TSP-1、CD36、CD47在肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)及人肝癌細(xì)胞株的選擇： TSP-1在人肝癌細(xì)胞株HCCLM3、HepG2中的表達(dá)量顯著低于人肝癌細(xì)胞株MHCC97、SMMC-7721中的表達(dá)；HCCLM3與HepG2相比TSP-1的表達(dá)量無顯著性差異。TSP-1的受體CD36在SMMC-7721中的表達(dá)低于HCCLM3和HepG2；CD47在HepG2中的表達(dá)低于HCCLM3和SMMC-7721

8、各細(xì)胞株中的表達(dá)，其他各組之間無差異。為了降低內(nèi)源性TSP-1的影響，選擇分泌TSP-1較少的，同時(shí)表達(dá)其受體CD36、CD47的細(xì)胞株HCCLM3作為實(shí)驗(yàn)對象。 3TSP-1濃度及作用時(shí)間點(diǎn)的選擇： 經(jīng)過MTT分析后結(jié)果顯示TSP-1對HCCLM3細(xì)胞的抑制作用在低于40μg/ml的濃度時(shí)有劑量依賴性，40μg/ml與50μg/ml相比抑制作用無差異。抑制作用也具有時(shí)間依賴性。作用24小時(shí)后各組的抑制作用既有差異，72

9、小時(shí)抑制率更為明顯。選擇40μg/ml作為實(shí)驗(yàn)濃度，作用72小時(shí)作為檢測點(diǎn)。 4TSP-1及其受體CD36、CD47對人肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 (1)抗體濃度的選擇及對生長和細(xì)胞周期的作用 不同的抗體濃度(1μg/105個(gè)細(xì)胞、2μg/105個(gè)細(xì)胞、5μg/105個(gè)細(xì)胞)阻滯TSP-1對生長的抑制作用效果無顯著差異，表明1μg/105個(gè)HCCLM3細(xì)胞數(shù)以上的濃度可以完全阻斷TSP-1與CD36及CD47的結(jié)合

10、。考慮到細(xì)胞生長的影響選擇5μg/105個(gè)細(xì)胞作為抗體阻斷組的抗體濃度。 MTT法檢測TSP-1對HCCLM3生長的作用結(jié)果顯示：TSP-1組、CD36阻斷組、CD47阻斷組細(xì)胞生長明顯低于對照組(與對照組相比抑制率分別為：25.97％，10.76％，20.23％)，各組之間兩兩比較也有顯著性差異。但CD36阻斷組與TSP-1組比較的差異遠(yuǎn)小于CD47阻斷組與TSP-1組的差異。 (2)對凋亡的作用 凋亡率：TS

11、P-1組(12.44±0.72％)顯著高于對照組(4.31±0.29％)，CD47阻斷組(4.99±0.12％)與對照組比較無差異，與TSP-1組相比差異顯著。CD36阻斷組(9.99±0.57％)與對照組和TSP-1組比較均有顯著性差異，但對于TSP-1的阻斷作用低于CD47抗體阻斷組。 電鏡觀察：對照組和CD47抗體阻斷組細(xì)胞生長旺盛，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器豐富，代謝活躍，細(xì)胞核分裂相多。TSP-1組細(xì)胞凋亡率增加，細(xì)胞質(zhì)各種細(xì)胞器

12、明顯減少，核分裂相減少，可見核碎裂，核濃縮，核邊際各種細(xì)胞凋亡的表現(xiàn)。CD36抗體阻斷組細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)與TSP-1組變化類似。 (3)對粘附的作用 TSP-1組(0.492±0.010；159.17±11.84)，CD36阻斷組(0.508±0.014，161.17±16.19)，CD47阻斷組(0.528±0.016，177.00±14.39)細(xì)胞粘附力均顯著低于對照組(0.607±0.035；219.83±14.19

13、)(p＜0.05)，但TSP-1組，CD36阻斷組，CD47阻斷組細(xì)胞粘附力兩兩之間無差異。 (4)對體外侵襲力的作用 通過Boyden小室的方法計(jì)算透過濾膜的細(xì)胞數(shù)檢測HCCLM3細(xì)胞的體外侵襲能力試驗(yàn)表明：TSP-1組的透過濾膜的細(xì)胞數(shù)顯著低于對照組(44.67±3.21vs77.33±4.51，p＜0.01)。CD47阻斷組和對照組相比有顯著性差異(53.67±3.06，77.33±4.51，p＜0.01)，CD4

14、7阻斷組和TSP-1組相比無顯著性差異(53.67±3.06，44.67±3.21，p＞0.05)。CD36阻斷組與對照組和TSP-1組相比結(jié)果均有顯著性差異(65.00±3.00vs44.67±3.21；77.33±4.51；＜0.01)。 (2)TSP-1對HCCLM3細(xì)胞Caspase3和MMP-9分泌的影響 TSP-1組(0.652±0.024)和CD36阻斷組(0.615±0.020)Caspase3/GAPD

15、H的光密度比值顯著高于對照組(0.398+0.033)和CD47阻斷組(0.432+0.019)(p＜0.05)，TSP-1組和CD36阻斷組之間、對照組和CD47阻斷組之間無顯著性差異。 6TSP-1對裸鼠種植瘤作用的研究 TSP-1治療組裸鼠種植瘤的體積(0.216±0.058mm3vs0.335±0.075mm3；p＜0.05)和重量(0.298±0.081gvs0.464±0.092g；p＜0.01)較對照組有顯

16、著降低。TSP-1治療組裸鼠種植瘤MVD顯著低于對照組(16.67±4.76vs28.17±4.96；p＜0.01) 四結(jié)論 1TSP-1在人肝癌細(xì)胞株HCCLM3，HepG2的表達(dá)低于MHCC97，SMMC-7721中的表達(dá)。TSP-1的受體CD36、CD47在各組中均有陽性表達(dá)。 2TSP-1通過與受體CD36的結(jié)合對人肝癌細(xì)胞株HCCLM3的生長有抑制作用，阻滯細(xì)胞停止于G0/G1期。對生長的抑制作用呈劑量

17、依賴性和時(shí)間依賴性，在超過40μg/ml后抑制作用不再增加。其受體CD47也發(fā)揮一定的作用。這種抑制作用不是通過調(diào)節(jié)TGF-Betal的分泌發(fā)揮作用的。 3TSP-1主要通過與受體CD47的結(jié)合上調(diào)Caspase3的表達(dá)誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株HCCLM3凋亡，TSP-1與CD36結(jié)合誘導(dǎo)凋亡的作用較弱，且不是通過調(diào)節(jié)Caspase3的表達(dá)進(jìn)行的。 4TSP-1可抑制人肝癌細(xì)胞株HCCLM3與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附能力和細(xì)胞遷移的能力