熱作用對人肝癌細胞株MHCC97作用的相關(guān)研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌主要以肝細胞肝癌（HCC）為主，是我國常見的惡性腫瘤。早期治療主要以手術(shù)切除為主。非手術(shù)療法包括全身化學(xué)藥物治療、分子靶向治療和局部物理化學(xué)治療等。熱療是近年出現(xiàn)的一種較新的腫瘤治療方法，目前已經(jīng)取得了較為確切的臨床療效。它可以誘導(dǎo)腫瘤細胞的凋亡，阻滯腫瘤細胞的有絲分裂周期，增強腫瘤細胞的免疫原性，正向調(diào)節(jié)機體免疫功能。但是由于其作用機制研究尚欠充分，影響了腫瘤熱療在臨床實踐的深入應(yīng)用。
　　人NDRG2基因即N-Myc

2、下游調(diào)節(jié)基因（N-myc down-stream regulated gene2），屬于NDRG家族。前期關(guān)于該基因的研究證實，NDRG2可以在很多正常組織中存在，參與細胞的生長、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等多種生理過程。在結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤等一些腫瘤組織中，NDRG2表達降低，但是在某些腫瘤細胞的應(yīng)激反應(yīng)過程中，發(fā)現(xiàn)NDRG2基因表達上調(diào)。有學(xué)者推測其可能作為一種抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　本研究通過觀察單次和多次熱作用對肝

3、癌細胞株 MHCC97細胞增殖、凋亡、周期以及NDRG2和HSP70蛋白表達的變化，初步探討熱療可能的分子作用機制。
　　研究方法和內(nèi)容：
　　將MHCC97細胞隨機分為1個對照組和4個實驗組，實驗組以43℃恒溫進行單次加熱，4個實驗組分別加熱0.5h、1h、1.5h、2h，對照組不加熱。5組細胞分別于培養(yǎng)時間3h、6h、9h、12h、24h后，觀察MHCC97細胞的形態(tài)改變，MTT法觀察各組細胞的增殖抑制情況，流式細胞術(shù)檢

4、測各組細胞的凋亡情況，得出MHCC97細胞的最佳熱療時間。根據(jù)此結(jié)果，進行多次熱作用，觀察細胞生長的改變。Western-blot法分別檢測單次和多次熱作用后細胞NDRG2和HSP70蛋白的表達。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行分析處理，進行析因設(shè)計方差分析，兩兩比較使用t檢驗，與對照組比較，P<0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　實驗結(jié)果：
　　1.熱作用對細胞形態(tài)的影響
　　對照組細胞貼壁生長良好，多角形，細胞

5、邊界清晰、透明，細胞連接成片，數(shù)量較多。經(jīng)過不同時間的43℃熱處理后，各實驗組MHCC97細胞的形態(tài)均發(fā)生不同程度改變，出現(xiàn)體積縮小、細胞皺縮，變梭形，部分細胞脫落等。以加熱2h后培養(yǎng)24h時細胞形態(tài)改變最明顯。
　　2.熱作用對細胞增殖的影響
　　43℃加熱后，各實驗組MHCC97細胞均受到不同程度的增殖抑制，以加熱1h且培養(yǎng)24h后最為明顯（抑制率為67.1％）。與單次加熱比較，多次加熱后細胞增殖抑制率有明顯升高（抑制率

6、89％）。
　　3.熱作用對細胞凋亡的影響
　　應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測肝癌細胞MHCC97熱作用后的凋亡情況，結(jié)果顯示：單次加熱可以使細胞凋亡率升高，并且隨著熱處理時間的延長，細胞凋亡率也隨之升高；實驗組的細胞凋亡率隨著加熱后培養(yǎng)時間的延長而升高，于加熱后培養(yǎng)時間為12h時達到高峰（各組凋亡率分別為2.7％、8.9％、23.3％、39.8％、57.5％），隨后開始出現(xiàn)降低趨勢；MHCC97細胞凋亡率在加熱2h后培養(yǎng)12h時達到最

7、大值（凋亡率為57.5％）；與單次熱作用相比，經(jīng)多次熱作用后，細胞凋亡率有所升高，以間隔48h再次加熱后培養(yǎng)24h時最高（凋亡率27.4％）。
　　4.熱作用對細胞NDRG2蛋白表達的影響
　　單次熱作用（43℃）能夠降低MHCC97細胞中NDRG2蛋白的表達，加熱后各組的NDRG2蛋白表達量低于對照組。在不同加熱時間的各實驗組中，以加熱1h后的NDRG2蛋白表達量下降的最明顯；在相同加熱時間的各實驗組中，4個實驗組各自進行

8、比較，隨著加熱后培養(yǎng)時間的延長，早期NDRG2蛋白表達略有下降，12-24h時降低最顯著。經(jīng)多次熱作用后， MHCC97細胞中NDRG2蛋白表達量有所降低，但是各實驗組之間未見明顯差異。
　　5.熱作用對細胞HSP70蛋白表達的影響
　　單次熱作用后（43℃），MHCC97細胞中HSP70蛋白的表達逐漸升高，以加熱2h后24h升高最顯著。多次熱作用后，HSP70蛋白表達亦升高，以間隔48h再次加熱后升高最為顯著。
　　

9、結(jié)論：
　　1.單次熱作用（43℃）對人肝癌細胞株MHCC97具有殺傷和抑制增殖作用，并能夠誘導(dǎo)其凋亡，發(fā)生G1期阻滯，同時降低NDRG2蛋白的表達，且使HSP70蛋白升高。
　　2.多次熱作用能夠?qū)HCC97細胞產(chǎn)生更強的殺傷作用。NDRG2在多次熱作用后無明顯變化趨勢。HSP70蛋白的表達在熱作用后升高，以間隔48h再次加熱組升高最明顯。
　　3.NDRG2可能具有細胞保護作用，并且可能間接參與細胞熱應(yīng)激反應(yīng)。<