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文檔簡介
1、真菌病害是限制牧草生長的主要因素之一,每年由于真菌病害給牧草和草坪草帶來了很大的經(jīng)濟(jì)損失.造成牧草產(chǎn)量下降,品質(zhì)變劣;草坪草褪色、黃化甚至枯死,影響草坪質(zhì)量降低利用年限.傳統(tǒng)的對真菌防治方法采用施用殺菌劑和農(nóng)藥,這會帶來環(huán)境的污染,危害人類的身體健康.而基因工程技術(shù)的興起,為我們提供了新的研究方法.本研究采用RT-PCR方法,從蘿卜葉片中提取總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,通過設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增特異,克隆得到抗真菌肽(antifungal
2、protein)基因,與pUC<,m>-T easy vector連接,轉(zhuǎn)化E.coli DH5 α,得到重組子pUC<,m>AFP,經(jīng)酶切和序列分析鑒定,改片段分子大小為240bp,通過序列對比分析發(fā)現(xiàn)與genebank中已發(fā)表的AFP堿基序列一致,有100.00﹪的同源性,將其序列翻譯成蛋白沒有終止子的出現(xiàn),表明可以進(jìn)行原核表達(dá)和植物載體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn).將此抗真菌肽基因克隆到E.coli表達(dá)載體pET28a,在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)出含有A
3、FP的11.99 OD,證明該AFP基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中可以正常表達(dá).從水稻葉片中提取基因組DNA,設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增特異引物,克隆單子葉特異表達(dá)啟動(dòng)子Actinl基因,與pUC<,m>-T easy vector連接,轉(zhuǎn)化E.coli DH5 α,得到重組子pUC<,m>Act,經(jīng)酶切和序列分析鑒定,該片段分子大小為1238bp,通過序列對比分析發(fā)現(xiàn)與己發(fā)表的Actinl堿基序列有99.60﹪的同源性.構(gòu)建Actinl啟動(dòng)子基因驅(qū)動(dòng)的AF
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