抗PD-1-PD-L1單克隆抗體的制備及其應(yīng)用于慢性乙型肝炎病毒感染治療的初步研究.pdf

1、慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染，可造成嚴(yán)重肝臟疾病，威脅人類健康。當(dāng)前針對慢性HBV感染的治療藥物主要包括干擾素類(Interferon)和核苷/核苷酸類似物(Nucleoside/Nucleotide analogues)兩類。治療慢性HBV感染的目標(biāo)是阻止重癥肝炎（肝衰竭）、肝硬化和肝癌等終末期肝臟疾病的發(fā)生，其臨床最佳治療終點是使患者達(dá)到乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)血清學(xué)陰轉(zhuǎn)或血清學(xué)轉(zhuǎn)換(

2、HBsAg loss or HBsAg SR)，但現(xiàn)有藥物實現(xiàn)該目標(biāo)的療效十分有限（1年期治療HBsAg陰轉(zhuǎn)率通常＜5％，延長治療HBsAg陰轉(zhuǎn)率通常亦＜10％），因此，針對慢性HBV感染者發(fā)展創(chuàng)新的、能促進(jìn)逆轉(zhuǎn)免疫耐受的創(chuàng)新治療藥物和方法是迫切而必要的。
　　 慢性HBV感染者通常缺乏有效的抗HBV免疫應(yīng)答，使得宿主無法有效清除體內(nèi)病毒。此種免疫耐受狀態(tài)可能是由于病毒免疫防御機制使得宿主免疫應(yīng)答活化通路被抑制而造成。新近研究表

3、明慢性HBV感染者免疫耐受狀態(tài)的形成與程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed cell death protein1，PD-1)及其配體(programmed cell death1 ligand1，PD-L1)相互作用而介導(dǎo)的免疫應(yīng)答負(fù)調(diào)控信號的活化密切相關(guān)。通過抗體或其他拮抗物阻斷該信號通路可能逆轉(zhuǎn)免疫耐受，從而刺激抗HBV特異性的T細(xì)胞活化，激活宿主抗HBV免疫應(yīng)答以促進(jìn)病毒的清除，是發(fā)展慢性HBV治療新藥物的重點研究方向之一

4、。
　　 本研究旨在獲得具有治療潛力的抗PD-1和抗PD-L1單克隆抗體，并在持續(xù)攜帶HBV的小鼠動物模型中初步探索其應(yīng)用于治療慢性HBV感染的可行性。我們利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)和系列層析純化手段，表達(dá)并純化獲得人源和鼠源的PD-1和PD-L1蛋白的胞外區(qū)(Human PD-1-aa21-aa170、HumanPD-L1-aa20-aa238、Mouse PD-1-aa1-a167、Mouse PD-L1-aa20-aa240

5、)，以此為基礎(chǔ)建立了檢測人及鼠PD-1/PD-L1重組蛋白體外相互作用的酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。采用純化后的人PD-1和人PD-L1蛋白作為免疫原免疫BALB/C小鼠，本研究共計制備了38株穩(wěn)定分泌鼠抗人PD-1和18株穩(wěn)定分泌鼠抗人PD-L1的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，通過間接化學(xué)發(fā)光免疫法評估了這些抗體與相應(yīng)人源及鼠源重組蛋白的反應(yīng)性，同時采用間接免疫熒光檢測分析這些抗體與穩(wěn)定表達(dá)hPD-1與hPD-L1的293細(xì)胞的反應(yīng)性，并定量

6、地評估了它們對PD-1/PD-L1體外相互作用的阻斷活性?；诳谷薖D-1/PD-L1對鼠PD-1/PD-L1具有交叉反應(yīng)性這一特點，我們在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中測試了其中代表性的6株Anti-PD1抗體和6株Anti-PD-L1抗體。結(jié)果顯示直接靜脈注射Anti-PD1或Anti-PD-L1抗體可使得HBV小鼠血清HBV DNA及HBsAg水平發(fā)生顯著降低，其中最為有效的兩株抗體，分別是Anti-PD-17A1和Anti-PD-L110E